Olverembatinib (GZD824) dimesylate Bcr-Abl inhibidor

GZD824 inhibe potentemente el crecimiento de células Ba/F3 que expresan Bcr-Abl de tipo salvaje con una IC50 de 1,0 nM. Altamente consistente con la inhibición bioquímica de la quinasa y la fuerte afinidad de unión a proteínas, GZD824 también inhibe fuertemente la proliferación de células Ba/F3 que expresan el mutante Bcr-AblT315I y otros 14 mutantes de Bcr-Abl relevantes para la resistencia. Además, GZD824 suprime eficientemente la activación de Bcr-Abl, así como de Crkl y STAT5 aguas abajo, de manera dependiente de la concentración en células K562 CML. [1]

Ensayo Z′-Lyte basado en FRET para la detección de la fosforilación del sustrato peptídico

Las quinasas ABL1, ABL1(E255K), ABL1 (G250E), ABL1(T315I) y ABL1(Y253F) son P3049, PV3864, PV3865, PV3866 y PV3863 son proteínas recombinantes humanas de longitud completa expresadas en células de insecto y marcadas con histidina. Las actividades de inhibición de los inhibidores contra Abl1 y sus mutantes se realizan en placas de 384 pocillos utilizando el sistema de ensayo Z′-Lyte basado en FRET. Brevemente, el sustrato de la quinasa se diluye en 5 μL de tampón de reacción de la quinasa; y se añade la quinasa. Los compuestos (10 nL) con las concentraciones indicadas se administran a la reacción utilizando un manipulador de líquidos Echo, y la mezcla se incuba durante 30 min a temperatura ambiente. Luego se añaden 5 μL de solución de ATP 2X para iniciar la reacción, y la mezcla se incuba durante 2 h adicionales a temperatura ambiente. Las reacciones resultantes contienen 10 μM (para Abl1 de tipo salvaje y los mutantes Y253F, Q252H, M351T y H396P) o 5 μM (para los mutantes E255K, G250E, T315I) de ATP, 2 μM de sustrato peptídico Tyr2 en 50 mM HEPES (PH 7.5), 0,01% BRIJ-35, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0,0247 μg/mL Abl1 e inhibidores según corresponda. Luego, se añaden 5 μL de reactivo de desarrollo, y la mezcla se incuba durante 2 h a temperatura ambiente antes de añadir 5 μL de solución de parada. La relación de la señal de fluorescencia de 445 nm (cumarina)/520 nm (fluoresceína) se examina en un lector multietiqueta EnVision. Los datos se analizan utilizando Graphpad Prism5. Los datos son el valor medio de tres experimentos.

GZD824, a dosis de 5 y 10 mg/kg/día, inhibe de forma dosis-dependiente el crecimiento tumoral en el xenoinjerto tumoral K562 y el modelo de xenoinjerto Ku812 sin mortalidad ni pérdida significativa de peso corporal. Además, GZD824 (20 mg/kg/día) suprime el crecimiento tumoral en ratones portadores de células Ba/F3 aloinjertadas que expresan Bcr-AblWT y Bcr-AblT315I. [1]