Rebastinib (DCC-2036) Bcr-Abl inhibidor

A conformational control inhibitor of Abl1 and T315I Abl1.

Rebastinib (DCC-2036) muestra potentes actividades inhibidoras contra Abl1 nativo purificado en formas no fosforiladas (u-Abl1^native) y fosforiladas (p-Abl1^native), Abl1^T315I mutante de guardián no fosforilado y fosforilado, y el mutante del bucle de activación Abl1^H396P de una manera no competitiva con ATP con valores de IC50 de 0,8 nM, 2 nM, 1,4 nM, 5 nM y 4 nM, respectivamente. Además, también inhibe las quinasas de la familia Src Src, LYN, FGR y HCK, y las TKs de receptor KDR, FLT3 y TIE2 con valores de IC50 de 34 nM, 29 nM, 38 nM, 40 nM, 4 nM, 2 nM y 6 nM, respectivamente. [1] Este compuesto muestra actividades antiproliferativas contra células Ba/F3 que expresan Bcr-Abl1 nativo o mutante con IC50 que van de 2 nM a 150 nM. Además, también inhibe la proliferación de la línea celular Ph⁺ K562 (IC50 5,5 nM), e induce potentemente la apoptosis tanto en células Ba/F3 como K562 que expresan Bcr-Abl1. [1] Un estudio reciente muestra que exhibe selectividad para la inhibición del crecimiento de células Bcr-Abl-positivas por su marcada inhibición de las líneas celulares de LMC en comparación con las líneas de leucemia no LMC. [2]

Ensayo de isoformas de la quinasa Abl1 y determinación de la potencia del inhibidor

La actividad de u-Abl1native se determina siguiendo la producción de ADP a partir de la reacción de la quinasa mediante el acoplamiento con el sistema piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa. En este ensayo, la oxidación de NADH (medida como una disminución de A340nm) se monitoriza continuamente por espectrofotometría. La mezcla de reacción final (100 μL, en una placa Corning de 384 pocillos) se prepara de la siguiente manera: Se prepara una mezcla de componentes de ensayo acoplado/quinasa Abl1 que contiene u-Abl1 quinasa (1 nM), Abltide (EAIYAAPFAKKK, 0,2 mM), MgCl₂ (9 mM), piruvato quinasa (~ 4 unidades), lactato deshidrogenasa (~ 0,7 unidades), fosfoenolpiruvato (1 mM) y NADH (0,28 mM) en 90 mM Tris que contiene 0,1 % de octil-glucósido y 1 % de DMSO, pH 7,5. Por separado, se prepara una mezcla de inhibidor que contiene Rebastinib (DCC-2036) diluido en serie 3 veces en DMSO, seguido de dilución en un tampón compuesto por 180 mM Tris, pH 7,5, que contiene MgCl₂ (18 mM) y 0,2 % de octil-glucósido. Cincuenta μL de la mezcla de inhibidor se mezclan con 50 μL de la mezcla de componentes de ensayo acoplado/quinasa Abl1 anterior, que luego se incuba a 30 °C durante 2 horas antes de añadir 2 μL de 25 mM ATP (500 μM, final) para iniciar la reacción. La reacción se registra cada 2 minutos durante 2,5 horas a 30 °C en un lector de placas Polarstar Optima o Synergy2. La velocidad de reacción (pendiente) se calcula utilizando el intervalo de tiempo de 1 a 2 horas con el software del lector. El porcentaje de inhibición se obtiene comparando la velocidad de reacción con la de un control de DMSO. Los valores de IC50 se calculan a partir de una serie de valores de porcentaje de inhibición determinados en un rango de concentraciones de inhibidor utilizando GraphPad Prism. El ensayo de quinasa para Abl1T315I, p-Abl1native o Abl1H396P se ensaya de la misma manera que el anterior, excepto que se utilizan 2,2 nM de Abl1T315I, 1 nM de p-Abl1 native o 1,3 nM de Abl1H396P. El formato de ensayo anterior también se utiliza para quinasas distintas de Abl1 con la excepción de TIE2, para el cual se utiliza un formato de polarización de fluorescencia/Transcreener. Las condiciones de ensayo son las mismas que se describen anteriormente, excepto que se utiliza PolyE4Y (1 mg/mL final) como sustrato y se utiliza una preincubación de una hora.

En un modelo de aloinjerto de ratón que porta células de leucemia Ba/F3-Bcr-Abl1T315I, el tratamiento con Rebastinib (DCC-2036) mediante sonda oral a 100 mg/kg una vez al día inhibe eficazmente la señalización de Bcr-Abl1 y prolonga significativamente la supervivencia del ratón. [1]