Rebastinib (DCC-2036) Bcr-Abl Inhibidor

A conformational control inhibitor of Abl1 and T315I Abl1.

Rebastinib (DCC-2036) shows potent inhibitory activities against purified native Abl1 in unphosphorylated (u-Abl1^native) and phosphorylated (p-Abl1^native) forms, unphosphorylated and phosphorylated gatekeeper mutant Abl1^T315I, and the activation loop mutant Abl1^H396P in a non-ATP-competitive manner with IC50 values of 0.8 nM, 2 nM, 1.4 nM, 5 nM, and 4 nM, respectively. Moreover, it also inhibits the Src family kinases Src, LYN, FGR, and HCK, and the receptor TKs KDR, FLT3, and TIE2 with IC50 values of 34 nM, 29 nM, 38 nM, 40 nM, 4 nM, 2 nM and 6 nM, respectively. [1] This compound shows anti-proliferative activities against Ba/F3 cells expressing native or mutant Bcr-Abl1 with IC50 ranging from 2 nM to 150 nM. In addition, it also inhibits proliferation of the Ph⁺ cell line K562 (IC50 5.5 nM), and induces apoptosis in both Bcr-Abl1-expressing Ba/F3 and K562 cells potently. [1] A recent study shows that it exhibits selectivity for growth inhibition of Bcr-Abl-positive cells by its marked inhibition of CML cell lines compared to non-CML leukemia lines. [2]

Ensayo de isoformas de la quinasa Abl1 y determinación de la potencia del inhibidor

La actividad de u-Abl1native se determina siguiendo la producción de ADP a partir de la reacción de la quinasa mediante el acoplamiento con el sistema piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa. En este ensayo, la oxidación de NADH (medida como una disminución de A340nm) se monitoriza continuamente por espectrofotometría. La mezcla de reacción final (100 μL, en una placa Corning de 384 pocillos) se prepara de la siguiente manera: Se prepara una mezcla de componentes de ensayo acoplado/quinasa Abl1 que contiene u-Abl1 quinasa (1 nM), Abltide (EAIYAAPFAKKK, 0,2 mM), MgCl₂ (9 mM), piruvato quinasa (~ 4 unidades), lactato deshidrogenasa (~ 0,7 unidades), fosfoenolpiruvato (1 mM) y NADH (0,28 mM) en 90 mM Tris que contiene 0,1 % de octil-glucósido y 1 % de DMSO, pH 7,5. Por separado, se prepara una mezcla de inhibidor que contiene Rebastinib (DCC-2036) diluido en serie 3 veces en DMSO, seguido de dilución en un tampón compuesto por 180 mM Tris, pH 7,5, que contiene MgCl₂ (18 mM) y 0,2 % de octil-glucósido. Cincuenta μL de la mezcla de inhibidor se mezclan con 50 μL de la mezcla de componentes de ensayo acoplado/quinasa Abl1 anterior, que luego se incuba a 30 °C durante 2 horas antes de añadir 2 μL de 25 mM ATP (500 μM, final) para iniciar la reacción. La reacción se registra cada 2 minutos durante 2,5 horas a 30 °C en un lector de placas Polarstar Optima o Synergy2. La velocidad de reacción (pendiente) se calcula utilizando el intervalo de tiempo de 1 a 2 horas con el software del lector. El porcentaje de inhibición se obtiene comparando la velocidad de reacción con la de un control de DMSO. Los valores de IC50 se calculan a partir de una serie de valores de porcentaje de inhibición determinados en un rango de concentraciones de inhibidor utilizando GraphPad Prism. El ensayo de quinasa para Abl1T315I, p-Abl1native o Abl1H396P se ensaya de la misma manera que el anterior, excepto que se utilizan 2,2 nM de Abl1T315I, 1 nM de p-Abl1 native o 1,3 nM de Abl1H396P. El formato de ensayo anterior también se utiliza para quinasas distintas de Abl1 con la excepción de TIE2, para el cual se utiliza un formato de polarización de fluorescencia/Transcreener. Las condiciones de ensayo son las mismas que se describen anteriormente, excepto que se utiliza PolyE4Y (1 mg/mL final) como sustrato y se utiliza una preincubación de una hora.

In a mouse allograft model bearing Ba/F3-Bcr-Abl1T315I leukemia cells, treatment with Rebastinib (DCC-2036) by oral gavage at 100 mg/kg once daily effectively inhibits Bcr-Abl1 signaling and significantly prolongs mouse survival. [1]