Rebastinib (DCC-2036)

La actividad de u-Abl1native se determina siguiendo la producción de ADP a partir de la reacción de la quinasa mediante el acoplamiento con el sistema piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa. En este ensayo, la oxidación de NADH (medida como una disminución de A340nm) se monitoriza continuamente por espectrofotometría. La mezcla de reacción final (100 μL, en una placa Corning de 384 pocillos) se prepara de la siguiente manera: Se prepara una mezcla de componentes de ensayo acoplado/quinasa Abl1 que contiene u-Abl1 quinasa (1 nM), Abltide (EAIYAAPFAKKK, 0,2 mM), MgCl₂ (9 mM), piruvato quinasa (~ 4 unidades), lactato deshidrogenasa (~ 0,7 unidades), fosfoenolpiruvato (1 mM) y NADH (0,28 mM) en 90 mM Tris que contiene 0,1 % de octil-glucósido y 1 % de DMSO, pH 7,5. Por separado, se prepara una mezcla de inhibidor que contiene Rebastinib (DCC-2036) diluido en serie 3 veces en DMSO, seguido de dilución en un tampón compuesto por 180 mM Tris, pH 7,5, que contiene MgCl₂ (18 mM) y 0,2 % de octil-glucósido. Cincuenta μL de la mezcla de inhibidor se mezclan con 50 μL de la mezcla de componentes de ensayo acoplado/quinasa Abl1 anterior, que luego se incuba a 30 °C durante 2 horas antes de añadir 2 μL de 25 mM ATP (500 μM, final) para iniciar la reacción. La reacción se registra cada 2 minutos durante 2,5 horas a 30 °C en un lector de placas Polarstar Optima o Synergy2. La velocidad de reacción (pendiente) se calcula utilizando el intervalo de tiempo de 1 a 2 horas con el software del lector. El porcentaje de inhibición se obtiene comparando la velocidad de reacción con la de un control de DMSO. Los valores de IC50 se calculan a partir de una serie de valores de porcentaje de inhibición determinados en un rango de concentraciones de inhibidor utilizando GraphPad Prism. El ensayo de quinasa para Abl1T315I, p-Abl1native o Abl1H396P se ensaya de la misma manera que el anterior, excepto que se utilizan 2,2 nM de Abl1T315I, 1 nM de p-Abl1 native o 1,3 nM de Abl1H396P. El formato de ensayo anterior también se utiliza para quinasas distintas de Abl1 con la excepción de TIE2, para el cual se utiliza un formato de polarización de fluorescencia/Transcreener. Las condiciones de ensayo son las mismas que se describen anteriormente, excepto que se utiliza PolyE4Y (1 mg/mL final) como sustrato y se utiliza una preincubación de una hora.

Ba/F3 cells and primary Ph⁺ leukemia cells

0-10 μM

72 hours

Ba/F3 cells or primary Ph⁺ leukemia cells are plated in triplicate in 96-well plates containing test compounds. After 72 hours, viable cells are quantified by Resazurin or MTT assay. Cells are diluted in medium to be added to each well of a 96-well tissue culture-treated plate. All cells are incubated overnight and maintained in a humidified atmosphere at 37 °C and 5% CO₂. Cells are treated the following day. Serum-free medium is used during treatment with Rebastinib (DCC-2036). MTT is used to assess the viability of cells following treatment. Aliquots of 20 mL of stock MTT solution are added to each well containing 200 mL of medium (10% final solution) and incubated with the cells for 2 hours. Following incubation the medium is removed and 200 mL of dimethylsulfoxide added to solubilize the formazan crystals. The absorbance is read on the plate reader at 550 and 690 nm. A subtraction analysis of the dual wavelength is performed (D550 to D690) to increase accuracy of the measurement.

Ba/F3 cells transformed to interleukin-3 independence by transduction with either Bcr-Abl1^native or Bcr-Abl1^T315I retrovirus are injected intravenously into syngeneic Balb/c mice.

≤100 mg/kg

Administered via p.o.