SU9516 CDK inhibidor

SU9516 disminuye la fosforilación específica de cdk2 de la proteína pRB del retinoblastoma, aumenta la activación de la caspasa-3 y altera el Cell Cycle en células RKO y SW480. Este compuesto también inhibe la proliferación celular e induce la apoptosis celular en ambas líneas celulares. [1] Mata células leucémicas mediante la inhibición de la fosforilación del CTD de la ARN Pol II, el daño oxidativo y la regulación transcripcional a la baja de Mcl-1. [2] En células Jurkat de leucemia de células T humanas, este químico mejora significativamente la sensibilidad al metotrexato. [3] Además, también suprime la localización centrosomal de Aurora-A y la consecuente amplificación del centrosoma. [4]

Ensayo de cinasa CDK

Los ensayos de cinasa se realizan en placas de polipropileno de 96 pocillos. Cada reacción contenía 2 μg de histona H1 a una concentración final de 10 μM [γ-³³P]ATP (0,2 μCi/pocillo; aproximadamente el doble del Km determinado experimentalmente), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,01% Triton X-100 y 10% glicerol en un volumen de 40 μL. La reacción se inicia con la adición de 20 μL de enzima (6 ng cdk2/pocillo, lo que resulta en una concentración final de 1,6 nM), que se diluye previamente 1:50–1:200 en el mismo tampón, y se deja proceder durante 1 h a temperatura ambiente. La reacción se detiene con la adición de 0,01 mL de ácido fosfórico al 10%, y 25 μL de la mezcla de reacción se transfieren a papel de filtro de fosfocelulosa P30. La almohadilla de filtro se lava tres veces con ácido fosfórico al 1,0%, se seca al aire y luego se cuenta la radioactividad en un contador de centelleo líquido. El ensayo de cinasa cdk4 para ciclina D1-cdk4 se lleva a cabo en un formato de microplaca de 96 pocillos de polipropileno midiendo la incorporación de fosfato radiactivo en GST-Rb. La ciclina D1-cdk4 purificada se incuba con 1 μg de GST-Rb en 20 mM HEPES (pH 7,5) en presencia de 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,01% Triton X-100 y 10% glicerol. La concentración final de cdk4 es de 10 ng/pocillo, o 1,6 nM. La reacción de cinasa se inicia con la adición de ATP a una concentración final de 10 μM ATP (el doble del Km determinado experimentalmente) y [γ-³³P]ATP (1,0 μCi por pocillo) en un volumen de 60 μL y se deja proceder a temperatura ambiente durante 1 h. La reacción se detiene con la adición de 0,01 ml de ácido fosfórico al 10%, y 25 μL de la mezcla de reacción se transfieren a papel de filtro de fosfocelulosa P30. La almohadilla de filtro se trata como en los ensayos Cdk1/Cdk2.