KW-2449 FLT3 inhibidor

Investigated as a FLT3 inhibitor in clinical trials, with others in early development.

KW-2449, un inhibidor multiquinasa de FLT3, ABL, ABL-T315I y Aurora kinase, está siendo investigado para tratar a pacientes con leucemia. Este compuesto muestra potentes efectos inhibidores del crecimiento en células de leucemia con mutaciones de FLT3 mediante la inhibición de la quinasa FLT3, lo que resulta en la regulación a la baja de FLT3/STAT5 fosforilado, detención en G1 y apoptosis. La administración oral de este químico muestra una inhibición del crecimiento tumoral dosis-dependiente y significativa en modelos de xenoinjerto con mutación de FLT3 con una supresión mínima de la médula ósea. En la leucemia humana de tipo salvaje FLT3, induce la reducción de la histona H3 fosforilada, la detención en G2/M y la apoptosis. En la leucemia resistente a Imatinib, este agente contribuye a liberar la resistencia mediante la regulación a la baja simultánea de las quinasas BCR/ABL y Aurora. La actividad inhibidora de este compuesto no se ve afectada por la presencia de proteínas plasmáticas humanas, como la glicoproteína α1-ácida. Tiene una potente actividad inhibidora del crecimiento contra varios tipos de leucemia por varios mecanismos de acción. Este inhibidor tiene una actividad significativa y justifica un estudio clínico en pacientes con leucemia con mutaciones de FLT3, así como mutaciones resistentes a Imatinib. Los niveles de fosforilación de FLT3 y STAT5 disminuyen por este químico de manera dosis-dependiente. Además, inhibe potentemente ABL-T315I, que se asocia con resistencia a IM, con un IC50 de 4 nM. Por otro lado, este compuesto tiene poco efecto sobre PDGFRβ, IGF-1R, EGFR y varias serina/treonina quinasas incluso a una concentración de 1 μM. Tiene potentes actividades inhibidoras del crecimiento no solo contra células de leucemia que expresan FLT3/ITD, sino también contra células de leucemia activadas por FLT3/KDM y células de leucemia que sobreexpresan FLT3 de tipo salvaje. De acuerdo con el efecto inhibidor del crecimiento, este agente suprime las fosforilaciones de FLT3 (P-FLT3) y su molécula aguas abajo fosfo-STAT5 (P-STAT5) en células MOLM-13 de manera dosis-dependiente. Además, aumenta el porcentaje de células en la fase G1 del ciclo celular y reduce recíprocamente el porcentaje de células en la fase S, lo que resulta en el aumento de la población de células apoptóticas. Este compuesto puede desfosforilar la quinasa WT-FLT3 constitutivamente activa, pero no inhibe la proliferación de células de leucemia si no son principalmente adictas a la quinasa FLT3. [1] Se absorbe rápidamente y se convierte en un metabolito principal M1. Los estudios preclínicos revelan que este químico es convertido por la monoamino oxidasa-B (MAO-B) y la aldehído oxidasa en su principal metabolito M1. Este agente media la citotoxicidad mediante la inhibición de FLT3/ITD. Es un inhibidor directo de FLT3 e induce la inhibición de su objetivo aguas abajo STAT5. [2] Este compuesto interactúa sinérgicamente con los HDACIs para inducir apoptosis en células de LMC Ph+ de manera dependiente del tiempo y la concentración. Mejora sinérgicamente la letalidad de vorinostat/SNDX275 en células de LMC. Estos regímenes inhibidores son activos contra células de leucemia Bcr/Abl⁺ adicionales resistentes a IM. Reduce moderadamente la fosforilación de la histona H3, un indicador de la actividad de Aurora B, en células K562 tratadas con nocodazol. [3]

Fosforilación de FLT3

Las células de leucemia se lavan en solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego se lisan resuspendiendo las células en tampón de lisis (20 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% Igepal, 1 mM EDTA, 2 mM NaVO₄, más inhibidor de proteasa completo KW-2449 durante 30 minutos mientras se agitan. El extracto se clarifica por centrifugación a 1.6 × 10⁴ g y el sobrenadante se analiza para detectar proteínas (Bio-Rad). Se retira una alícuota de 50 μg como lisado de células enteras para el análisis de STAT5, y el resto se usa para inmunoprecipitación con anti-FLT3. Se añade anticuerpo anti-FLT3 al extracto para incubación durante la noche, luego se añade sefarosa de proteína A durante 2 horas adicionales. Se corren en paralelo geles de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) separados para el lisado de células enteras y los inmunoprecipitados. Después de la transferencia a membranas Immobilon, se realiza un inmunoblotting con anticuerpo antifosfotirosina (4G10) para detectar FLT3 fosforilado o, para los geles de lisado de células enteras, con un anticuerpo monoclonal de rata contra STAT5 fosforilado (residuo Y694), luego se decapa y se vuelve a sondear con anticuerpo anti-FLT3 para medir el FLT3 total. Las proteínas se visualizan mediante quimioluminiscencia, se exponen en película Kodak BioMax XAR, se revelan y se escanean utilizando un densitómetro Bio-Rad GS800. La concentración de este compuesto para la cual la fosforilación de FLT3 o STAT5 se inhibe al 50% de su línea base (IC50) se determina mediante análisis de regresión lineal de las curvas de respuesta a la dosis. Para el análisis directo de FLT3 y STAT5 en blastos circulantes, se recolecta sangre periférica en tubos heparinizados y se enfría rápidamente en hielo. Las muestras se centrifugan durante 10 minutos a 900 g, a 4 °C. El plasma se retira y se almacena congelado a –80 °C. La capa leucocitaria se transfiere cuidadosamente a PBS frío, se estratifica sobre Ficoll-Hypaque frío y se centrifuga durante 5 minutos a 600 g, a 4 °C. Todos los pasos posteriores se realizan a 4 °C. Las células mononucleares se recolectan y se lavan rápidamente una vez en tampón de lisis de glóbulos rojos (0.155 M NH₄Cl, 0.01 M KHCO₃, 0.1 mM EDTA), luego se lavan una vez en PBS. Las células se lisan luego como se describe para el análisis de FLT3 y STAT5.

En el modelo de xenoinjerto tumoral MOLM-13, la administración oral de KW-2449 durante 14 días muestra un potente y significativo efecto antitumoral de manera dosis-dependiente. [1]