KW-2449

Las células de leucemia se lavan en solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego se lisan resuspendiendo las células en tampón de lisis (20 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% Igepal, 1 mM EDTA, 2 mM NaVO₄, más inhibidor de proteasa completo KW-2449 durante 30 minutos mientras se agitan. El extracto se clarifica por centrifugación a 1.6 × 10⁴ g y el sobrenadante se analiza para detectar proteínas (Bio-Rad). Se retira una alícuota de 50 μg como lisado de células enteras para el análisis de STAT5, y el resto se usa para inmunoprecipitación con anti-FLT3. Se añade anticuerpo anti-FLT3 al extracto para incubación durante la noche, luego se añade sefarosa de proteína A durante 2 horas adicionales. Se corren en paralelo geles de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) separados para el lisado de células enteras y los inmunoprecipitados. Después de la transferencia a membranas Immobilon, se realiza un inmunoblotting con anticuerpo antifosfotirosina (4G10) para detectar FLT3 fosforilado o, para los geles de lisado de células enteras, con un anticuerpo monoclonal de rata contra STAT5 fosforilado (residuo Y694), luego se decapa y se vuelve a sondear con anticuerpo anti-FLT3 para medir el FLT3 total. Las proteínas se visualizan mediante quimioluminiscencia, se exponen en película Kodak BioMax XAR, se revelan y se escanean utilizando un densitómetro Bio-Rad GS800. La concentración de este compuesto para la cual la fosforilación de FLT3 o STAT5 se inhibe al 50% de su línea base (IC50) se determina mediante análisis de regresión lineal de las curvas de respuesta a la dosis. Para el análisis directo de FLT3 y STAT5 en blastos circulantes, se recolecta sangre periférica en tubos heparinizados y se enfría rápidamente en hielo. Las muestras se centrifugan durante 10 minutos a 900 g, a 4 °C. El plasma se retira y se almacena congelado a –80 °C. La capa leucocitaria se transfiere cuidadosamente a PBS frío, se estratifica sobre Ficoll-Hypaque frío y se centrifuga durante 5 minutos a 600 g, a 4 °C. Todos los pasos posteriores se realizan a 4 °C. Las células mononucleares se recolectan y se lavan rápidamente una vez en tampón de lisis de glóbulos rojos (0.155 M NH₄Cl, 0.01 M KHCO₃, 0.1 mM EDTA), luego se lavan una vez en PBS. Las células se lisan luego como se describe para el análisis de FLT3 y STAT5.

MOLM-13 and RS4;11 cells

33nM, 75nM, 0.1μM, 0.3μM and 0.15μM

24, 48, and 72 hours

Cell viability is determined by the sodium 3′-[1-(phenylaminocarbonyl)-3, 4-tetrazolium]-bis (4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid hydrate assay after incubation with or without KW-2449 for 72 hours at 37 °C. The number of viable cells is determined using the Cell Proliferation Kit II. For cell-cycle analysis, MOLM-13 and RS4;11 cells are treated with this compound. After 24, 48, and 72 hours of incubation at 37 °C, DNA contents are analyzed. Cell cycle distribution of K562, TCC-Y, and TCC/Ysr is analyzed 24 hours after treatment with this chemical or imatinib.

CBySmn.CB17-Prkds^scid/J (BALB/C) mice are injected with BV173/E255K/Luc cl4 cells.

32 mg/kg/day, 5 days/week

Orally (p.o.) administered