LDN-57444 DUB inhibidor

El tratamiento con 50 μM de LDN-57444 durante 24 h conduce a una inhibición del 70% de la actividad del proteasoma. Este compuesto causa una disminución significativa y dependiente de la concentración en la viabilidad celular a concentraciones superiores a 25 μM y la viabilidad celular se redujo al 61,81% a 50 μM. Es capaz de causar la muerte celular a través de la vía de la apoptosis al disminuir la actividad del sistema ubiquitina proteasoma y aumentar los niveles de proteínas altamente ubiquitinadas, ambos pueden activar la respuesta a proteínas mal plegadas. La apoptosis inducida por este químico puede ser desencadenada por la activación del estrés del retículo endoplasmático (ERS). [4]

Cribado HTS

Para iniciar un ensayo, se alicuan 0,5 μL de compuesto de prueba de 5 mg/mL (aproximadamente 50 μM de concentración de reacción final) o control de DMSO en cada pocillo. Tanto la enzima como el sustrato se preparan en tampón de reacción UCH (50 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT y 0,5 mg/mL de ovoalbúmina). Luego se añaden 25 μL de 0,6 nM de UCH-L1 a cada pocillo, excepto a los pocillos de control del sustrato, seguido de una agitación de la placa durante 45-60 s en un agitador automático. La mezcla enzima/compuesto se incuba a temperatura ambiente durante 30 min antes de añadir 25 μL de 200 nM de Ub-AMC para iniciar la reacción enzimática. La mezcla de reacción (300 pM UCH-L1, 100 nM Ubiquitina-AMC con 2,5 μg de compuesto de prueba) se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos adicionales antes de detener la reacción mediante la adición de 10 μL de ácido acético 500 mM por pocillo. La intensidad de emisión de fluorescencia se mide en un analizador LJL utilizando un conjunto de filtros de cumarina (ex = 365 nm, em = 450 nm) y se resta la fluorescencia intrínseca del compuesto para revelar la actividad enzimática. También se realizan un control de DMSO (0,5 μL de DMSO, 25 μL de UCH-L1, 25 μL de ubiquitina-AMC, 10 μL de ácido acético), un control enzimático (25 μL de UCH-L1, 25 μL de tampón, 10 μL de ácido acético), un control de sustrato (25 μL de tampón, 25 μL de ubiquitina-AMC, 10 μL de ácido acético) y un control de inhibidor (0,5 μL de ubiquitina aldehído [stock de 100 nM], 25 μL de UCH-L1, 25 μL de ubiquitina-AMC, 10 μL de ácido acético) en cada placa de ensayo para garantizar la calidad y la reproducibilidad. Se seleccionan los posibles inhibidores de UCH-L1 si los compuestos demostraron una inhibición superior al 60% en comparación con los controles. Las reacciones enzimáticas de UCH-L1 se repiten manualmente dos veces utilizando el mismo protocolo para confirmar los resultados de los compuestos activos del cribado primario asistido por robot.

LDN-57444 provoca alteraciones dramáticas en la distribución de proteínas sinápticas y la morfología de las espinas in vivo. El tratamiento con este compuesto también resulta en una caída rápida de la actividad de Uch-L1, pero la inhibición del proteasoma no tiene efecto sobre los niveles de cAMP durante un período de varias horas. [3]