JIB-04 Histone Demethylase inhibidor

JIB-04 induce cambios transcripcionales de manera selectiva para el cáncer, incluyendo la regulación a la baja de genes proliferativos y la regulación al alza de genes antiproliferativos/pro-apoptóticos. Este compuesto bloquea el crecimiento de líneas de cáncer de pulmón y próstata con una IC50 tan baja como 10 nM, mientras que produce menos actividades antiproliferativas en HBECs y PrSCs/PrECs. [1]

Ensayos de actividad de Jumonji demethylase/prolil hidroxilasa/LSD1

El JMJD2E activo aa 1-350 se purifica de E.coli y se utiliza in vitro en presencia de α-cetoglutarato, 5-10 μM de hierro, ácido ascórbico y un sustrato peptídico de histona en una reacción acoplada con formaldehído deshidrogenasa suplementada con NAD+ para cuantificar la producción de NADH o utilizando el kit Epigentek P-3081. Para las reacciones de desmetilación de histonas cuantificadas por análisis Western, se expresa y purifica de E.coli un constructo de expresión de hJMJ2D aa 1-350 con etiqueta His, amablemente donado por los Dres. Y. Shi y J. Whetstine, siguiendo las instrucciones del manual de agarosa Qiagen Ni-NTA y el protocolo de Whestine et al 54. En resumen, la proteína se eluye en 50 mM TrisHCl pH 7.8 + 0.3 M NaCl + 10% Glicerol + 200 mM immidazol, y se dializa contra 20 mM TrisHCl pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.2 mM PMSF, 0.5 mM DTT, 8% glicerol. La enzima se alicuota, se congela rápidamente y se almacena a -80°C. Para los ensayos de actividad por Western blot, ~1.5 μg de enzima se combinan con 0.3 μg de sustrato H3K9me3 (Active Motif #31213) en 10 μM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 1 mM α-cetoglutarato y 2 mM L-ascorbato de sodio en 50 mM Hepes pH 7.9 en presencia de vehículo o fármaco y se incuban durante 30 min-2 horas a 37°C. Se añade tampón de carga SDS a las reacciones, y después de hervir, las muestras se corren en geles NuPage 4-12% Bis-Tris, se transfieren a nitrocelulosa y se blotean usando Upstate #07-523 para detectar H3K9me3. Para la detección de la señal total de H3, usamos Active Motif #39763 (primario) e IgG de burro anti-conejo conjugado con IRDye 680 (secundario, LI-COR # 926-32223) y se visualizaron los blots en un sistema de imagen infrarroja Odyssey amablemente proporcionado por el Dr. M. Cobb. Para las determinaciones de IC50 in vitro y los estudios de competición, típicamente se incuban 100-200 ng de proteína purificada con vehículo, JIB-04 o análogos, como se indica en las leyendas de las figuras, y la actividad se mide por ELISA (kit Epigentek P-3081 para la desmetilación de H3K9me3, P-3083 para la desmetilación de H3K4me3 y P-3085 para la desmetilación de H3K27me3) en reacciones que contienen 50mM Hepes pH 7.5, 0.01% Tween 20, 120nM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 1 mM α-cetoglutarato, 2 mM L-ascorbato de sodio y 50ng de sustrato peptídico. Las concentraciones finales de enzima en las reacciones fueron las siguientes: 206 nM JMJD2A, 12 nM JMJD2B, 60 nM JMJD2C, 90 nM JMJD2D E.coli, 30 nM JMJD2D Sf9, 30 nM JMJD2E, 30 nM Jarid1a, 35 nM JMJD3. Las lecturas de fondo se obtienen con enzimas inactivadas por calor, 0.5-1 mM 2,4 PDCA o reacciones sin 2-OG. hJMJD2A (aa1-350) purificado en E.coli es el amable regalo del Dr. Jose Rizo-Rey y se ensaya a 400 ng/reacción debido a su baja actividad intrínseca. Se utiliza el software GraphPad Prism para los cálculos de IC50 y el ajuste de curvas. JMJD2D de E.coli purificado por nosotros y JMJD2D de Sf9 de BPS dieron resultados indistinguibles. Tenga en cuenta que para los ensayos de competición de sustratos, con el fin de permanecer en el rango lineal del ensayo y no saturar la capacidad de unión de la placa ELISA, las reacciones con > 0.75 μM H3K9me3 contienen sustrato no biotinilado o se diluyen en el paso de detección y las señales se ajustan por factor de dilución. Para la cuantificación directa de la actividad de desmetilasa H3K9me3 en lisados celulares, las células tratadas (sembradas a 2 millones/placa de 10 cm) u homogeneizados tumorales en PBS se sonicaron (3x 4 seg) y se incubaron cantidades iguales de proteína con un sustrato de histona H3K9me3 en un tampón de reacción que contenía cofactores durante 2h a 37°C antes de la inmunodetección específica del producto H3K9me2 utilizando los reactivos del kit Epigentek P-3081. Se utilizan 500 ng de proteína PHD2 purificada de E.coli en 40 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 20% glicerol, 5 mM β-mercapto-etanol, 10 mM maltosa para obtener actividad en el rango lineal. Péptidos biotinilados derivados del ODD de HIF-1 (Biotin-Acp-DLDLEALAPYIPADDDFQL o Biotin-Acp-DLDLEALAP(OH)YIPADDDFQL como control hidroxilado) se inmovilizan en placas de 96 pocillos recubiertas con Neutravidina. La enzima se incuba en los pocillos recubiertos en tampón de reacción (20 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0.12 μM sulfato ferroso, 0.5 mM 2-oxoglutarato y 1 mM ascorbato) durante 45 min a temperatura ambiente en presencia de los fármacos indicados. El análogo competitivo de α-cetoglutarato, DMOG, se utiliza como control positivo para la inhibición. La hidroxilación de péptidos se detecta utilizando un anticuerpo policlonal de conejo generado contra un epítopo peptídico de HIF hidroxilado (anti-hidroxiprolina de conejo 4817, fabricado internamente), seguido de la adición de un anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con HRP. La luminiscencia se mide en un lector de placas EnVision. La actividad de la proteína recombinante LSD1 se mide utilizando el kit Epigentek P-3075 según el protocolo del fabricante con el inhibidor propietario.

En dos modelos de ratón con xenoinjertos separados (H358 o A549), JIB-04 disminuye el crecimiento tumoral, reduce la actividad de Jumonji histone demethylase en los tumores y prolonga la supervivencia al cáncer. [1]