(R)-(-)-Gossypol (AT-101) acetic acid Bcl-2 inhibidor

El AT-101 inhibe un panel de diferentes neoplasias linfoproliferativas con un IC50 que oscila entre 1,2 μM y 7,4 μM. El AT-101 (10 μM) altera el Δψm de manera dependiente de la concentración y el tiempo en líneas de linfoma difuso de células B grandes y de linfoma de células del manto. El AT-101 (1 μM o 2 μM) combinado con carfilzomib (6 nM o 10 nM) induce la apoptosis en las líneas celulares HBL-2 y Granta. [2] El AT-101 (20 μM durante 24 horas) produce una apoptosis mediana del 72 % y una regulación a la baja de Mcl-1 en linfocitos de LLC tanto en cultivo en suspensión como en cocultivo estromal. Las células estromales expresan niveles indetectables de antiapoptóticos, pero niveles altos de proteínas ERK y AKT activadas y tienen poca o ninguna apoptosis con AT-101. [3] El AT-101 induce la apoptosis de manera dependiente del tiempo y la dosis, con valores de ED50 de 1,9 mM y 2,4 mM en células Jurkat T y U937, respectivamente. El AT-101 (10 μM) combinado con radiación (32 Gy) induce más apoptosis que la radiación sola y excede la suma de los efectos causados por los tratamientos de agente único. El AT-101 activa SAPK/JNK de manera dependiente de la dosis y el tiempo. [4] El AT-101 (10 µM) induce la apoptosis a través de la activación de caspasa-9, -3 y -7 en células VCaP. El AT-101 (10 µM) disminuye la expresión de Bcl-2 y Mcl-1 en células VCaP. [5] El AT-101 (< 20 μM) es capaz de inhibir el crecimiento de células de mieloma múltiple a pesar de los efectos de crecimiento estimulantes proporcionados por las células estromales en el medio de la médula ósea. El AT-101 (10 μM) induce la apoptosis en células de mieloma múltiple a través de la activación de caspasas 3, caspasas 9 y PARP. El AT-101 (10 μM) promueve la apoptosis en células de mieloma múltiple al alterar la relación Bax/Bcl-2 y el potencial de membrana mitocondrial. [6]

Ensayo de unión basado en polarización de fluorescencia

Para los experimentos de unión competitiva, la proteína Bcl-2 (40 nM) y el péptido FAM-Bid (2,5 nM) se preincuban en el tampón de ensayo (100 mM fosfato de potasio, pH 7,5; 100 μg/mL globulina gamma bovina; 0,02 % azida de sodio). Se añaden 5 μL de una solución de AT101 en DMSO a la solución de Bcl-2/FAM-Bid en placas Dynex de 96 pocillos, negras y de fondo redondo para producir un volumen final de 125 μL. Para cada experimento, se incluyen en cada placa de ensayo un control que contiene Bcl-2 y péptido Flu-Bid (equivalente a 0 % de inhibición) y otro control que contiene solo FAM-Bid. Después de 4 horas de incubación, los valores de polarización en unidades de milipolarización (mP) se midieron a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm utilizando el lector de placas Ultra. El IC50, la concentración del inhibidor a la que se desplaza el 50 % del péptido unido, se determina a partir de la gráfica utilizando análisis de mínimos cuadrados no lineales y ajuste de curvas realizado con el software GraphPad Prizm 4. El péptido Bid BH3 sin marcar se utiliza como control positivo. PF para la proteína Bcl-xL, péptido Bak BH3 marcado con éster succinimidílico de 6-carboxifluoresceína (FAM-Bak) en lugar del FAM-Bim para maximizar la señal. Se determina que FAM-Bak tiene una Kd de 6 nM para la proteína Bcl-xL. El ensayo de unión competitiva para Bcl-xL es el mismo que para Bcl-2 con las siguientes excepciones: 30 nM de proteína Bcl-xL y 2,5 nM de péptido FAM-Bak en el siguiente tampón de ensayo: 50 mM Tris-Bis, pH 7,4 y 0,01 % de globulina gamma bovina. PF para la proteína Mcl-1, péptido FAM-Bid y proteína Mcl-1 humana. Se determina que el péptido FAM-Bid se une a la proteína Mcl-1 humana con una Kd de 1,71 nM. Los ensayos de unión competitiva para Mcl-1 se realizan de la misma manera que para Bcl-2 con las siguientes excepciones: 5 nM de Mcl-1 y 1 nM de péptido Flu-Bid en el siguiente tampón de ensayo: 25 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl y 0,05 % de ácido Plurónico.

El AT-101 sigue siendo detectable en plasma con concentraciones medias de 0,49 μM para el grupo de 35 mg/kg y 0,39 μM para el grupo de 200 mg/kg en ratones SCID beige portadores de xenoinjerto RL-DLBCL. La concentración plasmática máxima de AT-101 se observa después de 30 minutos de administración del fármaco en ambos niveles de dosis, mostrando el grupo de 200 mg/kg una concentración plasmática media casi 4 veces mayor que el grupo de 35 mg/kg (7,88 μM y 27,78 μM, respectivamente) en ratones SCID beige. El AT-101 (25 mg/kg a 100 mg/kg, oralmente) resulta indefinidamente en un inicio más temprano de pérdida de peso equivalente a más del 10% del peso previo al tratamiento y muerte en ratones SCID beige. El AT-101 (35 mg/kg, oralmente por día durante 10 días) más ciclofosfamida (Cy) intraperitoneal y rituximab (R) intraperitoneal muestran un control significativo del volumen tumoral en comparación con cualquier otro grupo de tratamiento. [2] El AT-101 (15 mg/kg, p.o., 5 días/semana) como agente único en ratones intactos reduce significativamente el desarrollo del crecimiento tumoral de VCaP en comparación con los tumores no tratados en las semanas 2 a 6. El AT-101 en combinación con la castración quirúrgica retrasa el inicio del crecimiento tumoral de VCaP independiente de andrógenos en comparación con los grupos de solo castración o solo AT-101 en ratones. [5]