NVP-BVU972 c-Met inhibidor

NVP-BVU972 inhibe potentemente la quinasa MET, pero muestra una baja inhibición contra otras quinasas, incluida la quinasa RON, la más estrechamente relacionada, con valores de IC50 superiores a 1000 nM. Este compuesto también suprime la fosforilación constitutiva de MET en células GTL-16 o la fosforilación de MET estimulada por HGF en células A549 con valores de IC50 de 7,3 nM y 22 nM, respectivamente. Previene potentemente el crecimiento de las líneas celulares GTL-16, MKN-45 y EBC-1 amplificadas por el gen MET con valores de IC50 de 66 nM, 82 nM y 32 nM, respectivamente. En línea con su alta frecuencia en esta pantalla de compuestos, las mutaciones Y1230 y D1228 dan lugar a cambios dramáticos en los valores de IC50 medidos para este en la línea celular BaF3. La resistencia desencadenada por V1155L es más limitada a este químico. Una reducción dosis-dependiente en la fosforilación de TPR-MET al aplicarlo a células BaF3 que expresan TPR-MET de tipo salvaje. Ambas mutaciones Y1230H y D1228A anularon el efecto de este compuesto, pero no de AMG 458. Sin embargo, F1200I y L1195V interfieren con su potencia para prevenir la fosforilación de TPR-MET.[1]

Ensayo bioquímico TR-FRET con MET de tipo salvaje y mutantes

La actividad enzimática se mide en un ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET), detectando la fosforilación de tirosina con un anticuerpo antifosfotirosina marcado con Eu (donante de fluorescencia) y aloficocianina conjugada con estreptavidina (aceptor de fluorescencia) que se une a una biotina en el péptido sustrato. Para cada variante, las concentraciones de K_m para ATP se determinan en ausencia de este compuesto, y la concentración de ATP en la reacción de la quinasa se ajusta a K_m (4 μM para MET wt, 1 μM para MET Y1230H y MET F1200I). Se disuelve y diluye en DMSO y se ensaya por cuadruplicado. Las reacciones de la quinasa se llevan a cabo en 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 8 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 0,05 % Tween 20, 0,05 % albúmina sérica bovina, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mM Na₃VO₄, en placas blancas de 1536 pocillos a temperatura ambiente. Este químico y la enzima se incuban en un volumen de 2 μL durante 20 min, seguido de la adición de 1 μL de ATP y 1 μL de péptido sustrato biotinilado (PTK1) a concentraciones finales de K_m y 1 μM, respectivamente. Las concentraciones enzimáticas en las reacciones son 5 nM para MET wt y 4 nM para las variantes F1200I y Y1230H. Después de 90 min, las reacciones se detienen con la adición de 1 μL de solución de parada/detección para alcanzar concentraciones finales de 10 mM EDTA, 3,5 nM de anticuerpo antifosfotirosina marcado con Eu PY20 y 10 nM de estreptavidina aloficocianina. La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo se mide en un lector de placas Envision (excitación 320 nm, emisión 615 nm y 665 nm).