Allitinib tosylate EGFR inhibidor

AST-1306 también es doble mutante de ErB2 y EGFR T790M/L858R. AST-1306 es aproximadamente 500 veces más potente que lapatinib y más de 3000 veces más selectivo para las quinasas de la familia ErbB que para otras familias de quinasas, incluyendo PDGFR, KDR y c-Met. AST-1306 podría unirse covalentemente a residuos de aminoácidos específicos de EGFR y ErbB2. AST-1306 actúa de manera dependiente de la concentración para inhibir significativamente el crecimiento de las células HIH3T3-EGFR T790M/L858R. AST-1306 suprime eficazmente la fosforilación de EGFR en las células HIH3T3-EGFR T790M/L858R. Además, AST-1306 bloquea el crecimiento de las células NCI-H1975 que albergan la mutación EGFR T790M/L858R de manera dependiente de la concentración. AST-1306 también bloquea la fosforilación de EGFR y las vías posteriores. Además, AST-1306 inhibe de manera dosis-dependiente y marcada la fosforilación de EGFR inducida por EGF en las células A549. AST-1306 inhibe la fosforilación de EGFR y ErbB2, y la señalización posterior en células cancerosas humanas, incluidas las células A549, Calu-3 y SK-OV-3. [1]

Ensayos de tirosina quinasa

Las actividades de tirosina quinasa se determinan en placas ELISA de 96 pocillos pre-recubiertas con 20 μg/mL de Poly (Glu,Tyr)4:1. Primero, se añaden 80 μL de solución de ATP 5 μM diluida en tampón de reacción de quinasa (50 mM HEPES pH 7.4, 20 mM MgCl₂, 0.1 mM MnCl₂, 0.2 mM Na₃VO₄, 1 mM DTT) a cada pocillo. Luego, se añaden diversas concentraciones de AST-1306 diluidas en 10 μL de DMSO al 1% (v/v) a cada pocillo de reacción, utilizando DMSO al 1% (v/v) como control negativo. Posteriormente, la reacción de la quinasa se inicia añadiendo proteínas de tirosina quinasa purificadas diluidas en 10 μL de solución de tampón de reacción de quinasa. Los experimentos en cada concentración se realizan por duplicado. Después de una incubación de 60 min a 37 °C, la placa se lava tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0.1% de Tween 20 (T-PBS). A continuación, se añaden 100 μL de anticuerpo anti-fosfotirosina (PY99, dilución 1:500) diluido en T-PBS que contiene 5 mg/mL de BSA. Después de 30 min de incubación a 37 °C, la placa se lava tres veces como antes. Se añade IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (100 μL) diluida 1:2000 en T-PBS que contiene 5 mg/mL de BSA. La placa se reincuba a 37 °C durante 30 min y luego se lava con PBS. Finalmente, se añaden 100 μL de una solución que contiene 0.03 % H2O2 y 2 mg/mL de o-fenilendiamina en tampón citrato 0.1 M, pH 5.5, y las muestras se incuban a temperatura ambiente hasta que aparece el color. La reacción se detiene añadiendo 50 μL de H2SO4 2 M, y la placa se lee utilizando un espectrofotómetro multipocillo a 490 nm. La tasa de inhibición (%) se calcula utilizando la siguiente ecuación: [1-(A490 tratado /A490 control)] ×100%. Los valores de IC50 se determinan a partir de los resultados de al menos tres pruebas independientes y se calculan mediante el método Logit.

La administración oral dos veces al día de AST-1306 da lugar a una prevención drástica del crecimiento tumoral en modelos de xenoinjertos SK-OV-3 y Calu-3. En los modelos SK-OV-3, los tumores casi desaparecen después del tratamiento con AST-1306 durante 7 días. En contraste, AST-1306 solo inhibe ligeramente el crecimiento del tumor en los modelos de xenoinjertos HO-8910 y A549. Por lo tanto, la eficacia antitumoral de AST-1306 es mayor en los modelos tumorales que sobreexpresan ErbB2 que en los modelos que expresan niveles bajos de ErbB2. AST-1306 es bien tolerado. Lapatinib muestra actividad antitumoral en estos modelos tumorales que sobreexpresan ErbB2, pero AST-1306 es más eficaz que lapatinib en el modelo de xenoinjerto tumoral SK-OV-3 cuando se administra a la misma dosis y pauta. Además, la administración oral de AST-1306 dos veces al día durante 3 semanas suprime drásticamente el crecimiento del tumor en los modelos FVB-2/N^neu. Después del tratamiento durante 11 días, los tumores desaparecen casi por completo. Los pesos corporales de los ratones se reducen en menos del 20% durante el tratamiento. [1]