CP-466722 ATM/ATR inhibidor

In vitro, CP-466722 se identifica como un potencial inhibidor para disminuir la actividad de la cinasa ATM purificada para fosforilar el sustrato GST-p53(1–101). Además, este compuesto también muestra actividades inhibidoras contra las cinasas abl y src. [1] En células HeLa, este compuesto a dosis de 6 μM, resulta en la inhibición de la fosforilación dependiente de ATM al inhibir reversiblemente la actividad de la cinasa ATM inducida por radiación ionizante (IR). Además, la inducción de p53 dependiente de ATM también es inhibida por este químico en células de cáncer de mama humano MCF-7 y fibroblastos humanos diploides primarios e inmortalizados. [1] En respuesta a IR, este compuesto aumentó la proporción de células con contenido de ADN G2/M y reduce la proporción de células con contenido de ADN en fase G1 en células HeLa. [1] La exposición transitoria a este químico durante un período de 4 horas sensibiliza las células HeLa a IR sin afectar el recubrimiento celular ni la viabilidad celular. [1]

Ensayos de cinasa in vitro [1]

Para la detección de pequeños inhibidores de moléculas de la actividad de la cinasa ATM, se adapta un ensayo de cinasa in vitro y se desarrolla un ensayo ELISA que mide el estado de fosforilación de la p53, el objetivo descendente de la ATM. La GST-p53(1-101) recombinante y la ATM y ATR de longitud completa marcadas con Flag se purifican para su uso en los ensayos ELISA y en los ensayos de cinasa in vitro. Brevemente, las placas Nunc 96 pocillos Maxisorp se recubren durante la noche (4 °C) con 2 μg de GST-p53(1-101) recombinante purificada en PBS. Todas las incubaciones posteriores se realizan a temperatura ambiente. Las placas se lavan (0,05 % v/v-Tween/PBS) antes de la adición de cinasa ATM recombinante purificada de longitud completa (30 ng–60 ng) en un volumen final de 80 μL de tampón de reacción (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂, 1 mM DTT y 1 μM ATP) en presencia o ausencia de CP-466722. Este compuesto (10 μM) se añade a las placas por duplicado y el ensayo de cinasa se incuba (90 minutos). Las placas se lavan (0,05 % v/v-Tween/PBS), se bloquean (1 hora, 1 % p/v-BSA/PBS) y se enjuagan antes de que se añada el anticuerpo anti-Fosfo(Ser15)-p53 (1:1000/PBS) a las placas y se incube (1 hora). Para reducir la unión no específica, las placas se lavan (0,05 % v/v-Tween/PBS) antes de la incubación (1 hora) con anticuerpo secundario IgG de cabra anti-conejo conjugado con HRP (1:5000/PBS). El anticuerpo secundario que está unido a la proteína GST-p53(1–101) fosforilada se detecta con el reactivo de sustrato TMB. Las placas se desarrollan (15 minutos–30 minutos) y la reacción se detiene (concentración final de 1 M H₂SO₄) antes de determinar la absorbancia (λ450nm). Este compuesto que inhibe la actividad de la cinasa ATM en los ensayos ELISA se caracteriza con respecto a la inhibición de las cinasas ATM/ATR utilizando ensayos de cinasa in vitro. Se utiliza Western blotting con el anticuerpo anti-Fosfo(Ser15)-p53 como lectura de la inhibición de ATM/ATR. Upstate realiza un análisis extendido de este químico (10 μM) contra un panel de cinasas disponible comercialmente.