CP-724714 HER2 Inhibidor

CP-724,714 is marked selectively against EGFR with IC50 of 6.4 μM. CP-724,714 is >1,000-fold less potent for IR, IGF-1R, PDGFRβ, VGFR2, abl. Src, c-Met c-jun NH2-terminal kinase (JNK)-2, JNK-3, ZAP-70, cyclin-dependent kinase (CDK)-2, and CDK-5. CP-724,714 potently reduces the EGF-induced autophosphorylation of the chimera containing the erbB2 kinase domain with IC50 of 32 nM, but is markedly less potent against EGFR in transfected NIH3T3 cells. CP-724,714 sensitively inhibits the proliferation of erbB2-amplified cells including BT-474 and SKBR3, with IC50 of 0.25 and 0.95 μM. CP-724,714 induces the accumulation of cells in G1 phase and a marked reduction in S-phase in BT-474 cells at 1 μM. [1] CP-724,714 likely exerts its hepatotoxicity via both hepatocellular injury and hepatobiliary cholestatic mechanisms. CP-724,714 displays inhibition of cholyl-lysyl and taurocholate (TC) efflux into canaliculi in cryopreserved and fresh cultured human hepatocytes, respectively. CP-724,714 inhibits TC transport in membrane vesicles expressing human bile salt export pump with IC50 of 16 μM and inhibits the major efflux transporter in bile canaliculi, MDR1, with IC50 of ~28 μM. [2]

Ensayos de quinasas

Los dominios intracelulares recombinantes de erbB2 (residuos de aminoácidos 675-1255) y EGFR (residuos de aminoácidos 668-1211) se expresan en células Sf9 infectadas con baculovirus como proteínas de fusión S-transferasa. Las proteínas se purifican mediante cromatografía de afinidad en perlas de Sepharose para su uso en el ensayo. Las placas Nunc MaxiSorp de 96 pocillos se recubren mediante incubación durante la noche a 37 °C con 100 μL/pocillo de 0,25 mg/mL de poli(Glu:Tyr, 4:1), PGT en PBS. El exceso de PGT se elimina por aspiración y la placa se lava 3 veces con tampón de lavado (0,1 % de Tween 20 en PBS). La reacción de la quinasa se realiza en 50 μL de 50 mM HEPES (pH 7,4) que contiene 125 mM de cloruro de sodio, 0,1 mM de ortovanadato de sodio, 1 mM de ATP y ~15 ng de proteína recombinante. Se añaden inhibidores en DMSO; la concentración final de DMSO es del 2,5 %. La fosforilación se inicia mediante la adición de ATP y se prosigue durante 6 minutos a temperatura ambiente, con agitación constante. La reacción de la quinasa se detiene por aspiración de la mezcla de reacción y lavado cuatro veces con tampón de lavado. El PGT fosforilado se mide después de una incubación de 25 minutos con 50 μL/pocillo de anticuerpo anti-fosfotirosina PY54 conjugado con HRP, diluido a 0,2 μg/mL en tampón de bloqueo (3 % de BSA, 0,05 % de Tween 20 en PBS). El anticuerpo se retira por aspiración y la placa se lava cuatro veces con tampón de lavado. La señal colorimétrica se desarrolla mediante la adición de 50 μL/pocillo de substrato de peroxidasa de micropocillos de tetrametilbencidina y se detiene mediante la adición de 50 μL/pocillo de ácido sulfúrico 0,09 M. El producto de fosfotirosina formado se estima mediante la medición de la absorbancia a 450 nm. La señal para los controles es típicamente A0,6–1,2, con esencialmente ningún fondo en pocillos sin ATP, proteína quinasa o PGT, y es proporcional al tiempo de incubación durante 6 min.

CP-724,714 (25 mg/kg) is rapidly absorbed after p.o. administration and causes reduction of tumor erbB2 receptor phosphorylation after dosing in FRE-erbB2 or BT-474 xenografts. CP-724,714 induces apoptosis in FRE-erbB2 xenograft–bearing (s.c.) mice and shows 50% tumor growth inhibition at 50 mg/kg, without weight loss or mortality. CP-724,714 also has great antitumor activity in MDA-MB-453, MDA-MB-231, LoVo (colon), and Colo-205 (colon) xenografts. Furthermore, CP-724,714 (30 or 100 mg/kg) reduces the extracellular signal–regulated kinase and Akt phosphorylation in BT-474 xenografts. [1]