CP-724714

CP-724,714 está marcado selectivamente contra EGFR con una IC50 de 6,4 μM. CP-724,714 es >1.000 veces menos potente para IR, IGF-1R, PDGFRβ, VGFR2, abl. Src, c-Met c-jun NH2-terminal quinasa (JNK)-2, JNK-3, ZAP-70, quinasa dependiente de ciclina (CDK)-2 y CDK-5. CP-724,714 reduce potentemente la autofosforilación inducida por EGF de la quimera que contiene el dominio quinasa erbB2 con una IC50 de 32 nM, pero es notablemente menos potente contra EGFR en células NIH3T3 transfectadas. CP-724,714 inhibe sensiblemente la proliferación de células amplificadas con erbB2, incluyendo BT-474 y SKBR3, con una IC50 de 0,25 y 0,95 μM. CP-724,714 induce la acumulación de células en fase G1 y una marcada reducción en fase S en células BT-474 a 1 μM. [1] CP-724,714 probablemente ejerce su hepatotoxicidad a través de mecanismos de lesión hepatocelular y colestáticos hepatobiliares. CP-724,714 muestra inhibición del eflujo de colil-lisil y taurocolato (TC) hacia los canalículos en hepatocitos humanos criopreservados y cultivados frescos, respectivamente. CP-724,714 inhibe el transporte de TC en vesículas de membrana que expresan la bomba de exportación de sales biliares humanas con una IC50 de 16 μM e inhibe el principal transportador de eflujo en los canalículos biliares, MDR1, con una IC50 de ~28 μM. [2]

CP-724,714 (25 mg/kg) se absorbe rápidamente después de la administración p.o. y provoca una reducción de la fosforilación del receptor erbB2 tumoral después de la dosificación en xenoinjertos FRE-erbB2 o BT-474. CP-724,714 induce apoptosis en ratones (s.c.) portadores de xenoinjertos FRE-erbB2 y muestra una inhibición del crecimiento tumoral del 50 % a 50 mg/kg, sin pérdida de peso ni mortalidad. CP-724,714 también tiene una gran actividad antitumoral en xenoinjertos MDA-MB-453, MDA-MB-231, LoVo (colon) y Colo-205 (colon). Además, CP-724,714 (30 o 100 mg/kg) reduce la fosforilación de la quinasa regulada por señal extracelular y Akt en xenoinjertos BT-474. [1]

• Ensayos de quinasas

  Los dominios intracelulares recombinantes de erbB2 (residuos de aminoácidos 675-1255) y EGFR (residuos de aminoácidos 668-1211) se expresan en células Sf9 infectadas con baculovirus como proteínas de fusión S-transferasa. Las proteínas se purifican mediante cromatografía de afinidad en perlas de Sepharose para su uso en el ensayo. Las placas Nunc MaxiSorp de 96 pocillos se recubren mediante incubación durante la noche a 37 °C con 100 μL/pocillo de 0,25 mg/mL de poli(Glu:Tyr, 4:1), PGT en PBS. El exceso de PGT se elimina por aspiración y la placa se lava 3 veces con tampón de lavado (0,1 % de Tween 20 en PBS). La reacción de la quinasa se realiza en 50 μL de 50 mM HEPES (pH 7,4) que contiene 125 mM de cloruro de sodio, 0,1 mM de ortovanadato de sodio, 1 mM de ATP y ~15 ng de proteína recombinante. Se añaden inhibidores en DMSO; la concentración final de DMSO es del 2,5 %. La fosforilación se inicia mediante la adición de ATP y se prosigue durante 6 minutos a temperatura ambiente, con agitación constante. La reacción de la quinasa se detiene por aspiración de la mezcla de reacción y lavado cuatro veces con tampón de lavado. El PGT fosforilado se mide después de una incubación de 25 minutos con 50 μL/pocillo de anticuerpo anti-fosfotirosina PY54 conjugado con HRP, diluido a 0,2 μg/mL en tampón de bloqueo (3 % de BSA, 0,05 % de Tween 20 en PBS). El anticuerpo se retira por aspiración y la placa se lava cuatro veces con tampón de lavado. La señal colorimétrica se desarrolla mediante la adición de 50 μL/pocillo de substrato de peroxidasa de micropocillos de tetrametilbencidina y se detiene mediante la adición de 50 μL/pocillo de ácido sulfúrico 0,09 M. El producto de fosfotirosina formado se estima mediante la medición de la absorbancia a 450 nm. La señal para los controles es típicamente A0,6–1,2, con esencialmente ningún fondo en pocillos sin ATP, proteína quinasa o PGT, y es proporcional al tiempo de incubación durante 6 min.

• Líneas celulares

  ZR-75-30, HCC-1419, MDA-MB-175, BT-474, SKBR3, MDA-MB-361, UACC-812, T-47D, MDA-MB-453, MDA-MB-468, CAMA-1, MDA-MB-157, MCF-7, MDA-MB-435, ZR-75-1, BT-20, and MDA-MB-231.

• Concentraciones

  0.1 nM - 10 μM.

• Tiempo de incubación

  6 to 7 days.

• Método

  Cells are seeded in duplicate at 5~10 × 10³ per well in 24-well plates. The day after plating, CP-724,714 is added by titrating over six or more dilutions from 0.1 nM to 10 μM. Control wells without CP-724,714 are seeded as well. Cells are grown for 6 to 7 days, at which time surviving cells are counted. After trypsinization, cells are placed in isotone solution and counted immediately using a Coulter Z2 particle counter. Growth inhibition is calculated [(1− experimental value / control value) × 100] for each concentration. Dose-response curves are repeated at least twice and averaged. IC50 values are calculated using Calcusyn Software.

• Modelos animales

  FRE-erbB2 BT-474, MDA-MB-453, MDA-MB-231, LoVo (colon), and Colo-205 (colon) xenografts are established in athymic female mice (CD-1 nu/nu).

• Dosificaciones

  ~100 mg/kg.

• Administración

  Administered via p.o.