OSI-930 c-Kit inhibidor

OSI-930 inhibe la proliferación celular en la línea celular HMC-1 con una IC50 de 14 nM sin un efecto significativo en el crecimiento de la línea celular COLO-205 que no expresa un receptor de tirosina quinasa mutante constitutivamente activo. Además, este compuesto también induce la apoptosis en la línea celular HMC-1 con una EC50 de 34 nM. [1] Un estudio reciente muestra que este químico inactiva el citocromo P450 (P450) 3A4 purificado y recombinante con un K_i de 24 μM de manera dependiente del tiempo y la concentración. [2]

Ensayos de proteína quinasa

Los ensayos de proteína quinasa se realizan internamente mediante métodos de ensayo basados en ELISA (Kit, KDR, PDGFRα y PDGFRβ) o mediante un método radiométrico. Los ensayos ELISA internos utilizaron poli(Glu:Tyr) como sustrato unido a la superficie de placas de ensayo de 96 pocillos; la fosforilación se detecta luego utilizando un anticuerpo antifosfotirosina conjugado a HRP. El anticuerpo unido se cuantifica luego usando ABTS como sustrato de peroxidasa midiendo la absorbancia a 405/490 nm. Todos los ensayos utilizan dominios catalíticos de quinasa recombinantes purificados que se expresan en células de insectos o en bacterias. La proteína Kit y EGFR utilizada para los ensayos internos se prepara internamente; otras enzimas se obtienen. La proteína Kit recombinante se expresa como una proteína de fusión glutatión S-transferasa NH₂-terminal en células de insectos y se purifica inicialmente como una enzima no fosforilada (no activada) con una K_m relativamente alta para ATP (400 μM). En algunos ensayos, se prepara una forma activada (tirosina fosforilada) de la enzima mediante incubación con 1 mM de ATP durante 1 hora a 30 °C. La proteína fosforilada se pasa luego a través de una columna de desalación para eliminar la mayor parte del ATP y se almacena a -80 °C en un tampón que contiene 50% de glicerol. La preparación resultante tiene una actividad específica considerablemente mayor y una Km para ATP (25 μM) menor que la preparación inicial no fosforilada. La inhibición de la autofosforilación de Kit por este compuesto se ensaya mediante incubación de la enzima no fosforilada a 30 °C en presencia de 200 μM de ATP y varias concentraciones de este químico. La reacción se detiene retirando alícuotas en tampón de muestra SDS-PAGE y luego calentando a 100 °C durante 5 minutos. El grado de fosforilación de Kit se determina luego mediante inmunoblotting para Kit total y Kit fosforilado.

OSI-930, administrado a la dosis máxima eficaz de 200 mg/kg por sonda gástrica oral, exhibe una potente actividad antitumoral en una amplia gama de modelos de xenoinjertos preclínicos, incluyendo los modelos de xenoinjertos HMC-1, NCI-SNU-5, COLO-205 y U251. [1]