WAY-600 mTOR inhibidor

El ensayo de quinasa en inmunocomplejos muestra que el sustrato específico de mTORC2 His6-AKT o el sustrato de mTORC1 His6-S6K son inhibidos de forma dosis-dependiente por WAY-600. Este compuesto inhibe globalmente la señalización de mTOR y la función de AKT en modelos celulares de forma dosis-dependiente. Inhibe profundamente la síntesis de proteínas dependiente de cap y global en células de cáncer de mama humano MDA361. Este químico muestra efectos antiproliferativos en varias líneas celulares cancerosas que implican la detención del ciclo celular en G1 y apoptosis selectiva. Regula a la baja los factores angiogénicos, VEGF y HIF-1α, en células U87MG, MDA361 y LNCap. [1]

Formato DELFIA de FLAG-TOR purificado

Los ensayos de rutina con FLAG-TOR purificado (FL y 3.5) se realizan en placas de 96 pocillos de la siguiente manera. Las enzimas se diluyen primero en tampón de ensayo de quinasa (10 mM Hepes (pH 7.4), 50 mM NaCl, 50 mM β-glicerofosfato, 10 mM MnCl₂, 0.5 mM DTT, 0.25 lM microcistina LR y 100 lg/mL BSA). En cada pocillo, se mezclan brevemente 12 μL de la enzima diluida con 0.5 μL de inhibidor de prueba o vehículo de control dimetilsulfóxido (DMSO). La reacción de quinasa se inicia añadiendo 12.5 μL de tampón de ensayo de quinasa que contiene ATP y His6-S6K para dar un volumen de reacción final de 25 μL que contiene 800 ng/mL de FLAG-TOR, 100 μM de ATP y 1.25 μM de His6-S6K. La placa de reacción se incuba durante 2 horas (lineal de 1 a 6 horas) a temperatura ambiente con agitación suave y luego se detiene añadiendo 25 μL de tampón de parada (20 mM Hepes (pH 7.4), 20 mM EDTA y 20 mM EGTA). La detección DELFIA del His6-S6K fosforilado (Thr-389) se realiza a temperatura ambiente utilizando un anticuerpo monoclonal anti-P(T389)-p70S6K (1A5) marcado con Europio-N1-ITC (Eu) (10.4 Eu por anticuerpo). Cuarenta y cinco microlitros de la mezcla de reacción de quinasa terminada se transfieren a una placa MaxiSorp que contiene 55 μL de PBS. Se permite que el His6-S6K se adhiera durante 2 horas, después de lo cual los pocillos se aspiran y se lavan una vez con PBS. Se añaden cien microlitros de tampón DELFIA con 40 ng/mL de anticuerpo Eu-P(T389)-S6K. La unión del anticuerpo continúa durante 1 hora con agitación suave. Los pocillos se aspiran y se lavan cuatro veces con PBS que contiene 0.05% de Tween 20 (PBST). Se añaden cien microlitros de solución de mejora DELFIA a cada pocillo y las placas se leen en un lector de placas modelo PerkinElmer Victor. Los datos obtenidos se utilizan para calcular la actividad enzimática y la inhibición enzimática por posibles inhibidores.