AZD2858 GSK-3 inhibidor

AZD2858 es un inhibidor selectivo de GSK-3 con una IC50 de 68 nM, que inhibe la fosforilación de tau en el sitio S396 y activa la vía de señalización Wnt. El tratamiento con este compuesto (1 μM, 12 h) en células primarias aisladas de tipo osteoblasto humano da como resultado un aumento de 3 veces los niveles de β-catenina. [1] Provoca la estabilización de β-catenina en células madre mesenquimales humanas y de rata, estimula el compromiso de las hADSC hacia los osteoblastos y la mineralización osteogénica in vitro. [2]

Ensayo de fosforilación de Tau

Se utilizan células NIH-3T3 que expresan Tau de 4 repeticiones para evaluar la actividad funcional de AZD2858 in vitro. Las células se cultivan en medio DMEM, 2 mM de L-glut y 10 % de HiFCS, y se siembran a una concentración de 6×10⁵ células/pozo en placas de 6 pozos. En cada experimento, este compuesto se dosifica por triplicado a una concentración de 1, 10, 100, 500, 1000, 2000 y 10 000 nM. Las células se tratan durante 4 h antes de la lisis celular utilizando 100 μL de tampón de lisis frío (0,5 % NP-40, 10 mM Tris, pH 7,2, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA). Se prepara una suspensión con la adición de inhibidores de proteasa y fosfatasa: 50 mM NaF, 0,2 mM NaVO4 y cóctel de inhibidores de proteasa. La solución se congela rápidamente a – 80 °C durante al menos 1 h, antes de descongelarla en hielo y clarificar el lisado por centrifugación, seguido de Western blot según los protocolos estándar. Después del bloqueo, las membranas se exponen al anticuerpo primario, Phospho-Ser396-tau (1:1000) durante la noche, se lavan y se incuban con el anticuerpo secundario (burro anti-conejo, 1:5000), seguido de un lavado final. Para la reprobación, se utilizan el anticuerpo primario Tau5 (1:200) y el anticuerpo secundario unido a peroxidasa de rábano picante (oveja anti-ratón, 1:10000). Todas las membranas se desarrollan utilizando reactivos de detección de Western blot ECL, películas de rayos X Kodak, se cuantifican mediante análisis densitométrico y se calcula la relación de S396 tau a tau total (tau5).

En ratas, el tratamiento oral con AZD2858 causa un aumento dosis-dependiente en la masa ósea trabecular en comparación con el control después de un tratamiento de dos semanas con un efecto máximo a una dosis de 20 mg/kg una vez al día (BMC total: 172 % del control). También se observa un efecto pequeño pero significativo en los sitios corticales (BMC total: 111 % del control). [1] Este compuesto (30 μmol/kg) administrado a ratas diariamente durante hasta 3 semanas muestra un aumento tanto en la densidad mineral (del 28 % a las 2 semanas y del 38 % a las 3 semanas) como en el contenido mineral (del 81 % a las 2 semanas y del 93 % a las 3 semanas) en los callos. Este tratamiento hace que las fracturas se curen más rápidamente, con un callo óseo sin un componente endocondral obvio. [3] Produce cambios dependientes del tiempo en los biomarcadores séricos de recambio óseo y aumenta la masa ósea durante 28 días de exposición en ratas. Después de 7 días, este compuesto aumenta el biomarcador de formación ósea P1NP y reduce el biomarcador de resorción TRAcP-5b, lo que indica un aumento del anabolismo óseo y una reducción de la resorción en ratas. [2]