AMG319 PI3K inhibidor

AMG319 inhibe la proliferación de células B inducida por anti-IgM/CD40L con una IC50 de 8,6 nM y reduce el nivel de pAkt con una IC50 de 1,5 nM. Este compuesto también inhibe la expresión de CD-69 inducida por anti-IgD en HWB. [1]

Ensayos enzimáticos de PI3K

Se utiliza un ensayo Alphascreen de PI3K para medir la actividad de un panel de cuatro fosfoinosítido 3-quinasas: PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kγ y PI3Kδ. El tampón de reacción enzimática se prepara usando agua estéril y 50 mM Tris-HCl, pH 7, 14 mM MgCl₂, 2 mM colato de sodio y 100 mM NaCl. Se añaden 2 mM de DTT fresco el día del experimento. El tampón Alphascreen se prepara usando agua estéril y 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,10 % Tween 20 y 30 mM EDTA. Luego se añade 1 mM de DTT fresco el día del experimento. Las placas fuente de compuestos utilizadas para este ensayo son placas de polipropileno transparente Greiner de 384 pocillos que contienen compuestos de prueba a 5 mM y diluidos 1:2 en 22 concentraciones. Las columnas 23 y 24 contenían solo DMSO, ya que estos pocillos comprendían los controles positivo y negativo, respectivamente. Las placas fuente se replican transfiriendo 0,5 μL por pocillo a Optiplates de 384 pocillos. Cada isoforma de PI3K se diluye en tampón de reacción enzimática a stocks de trabajo 2×. PI3Kα se diluye a 1,6 nM, PI3Kβ se diluye a 0,8 nM, PI3Kγ se diluye a 15 nM y PI3Kδ se diluye a 1,6 nM. PI(4,5)P2 se diluye a 10 μM y el ATP se diluyó a 20 μM. Este stock 2× se utiliza en los ensayos para PI3Kα y PI3Kβ. Para el ensayo de PI3Kγ y PI3Kδ, PI(4,5)P2 se diluye a 10 μM y el ATP se diluyó a 8 μM para preparar un stock de trabajo 2× similar. Las soluciones de reacción Alphascreen se preparan usando perlas del kit Alphascreen anti-GST. Se preparan dos stocks de trabajo 4× de los reactivos Alphascreen en tampón de reacción Alphascreen. En un stock, el IP4 biotinilado se diluye a 40 nM y las perlas donadoras de estreptavidina se diluyen a 80 μg/mL. En el segundo stock, la proteína de unión a PIP3 se diluye a 40 nM y las perlas aceptoras anti-GST se diluyen a 80 μg/mL. Como control negativo, se incluye un inhibidor de referencia a una concentración ≫Ki (40 μM) en la columna 24 como control negativo (100 % de inhibición). Usando un Multidrop de 384 pocillos, se añaden 10 μL/pocillo de stock enzimático 2× a las columnas 1–24 de las placas de ensayo para cada isoforma. Luego se añaden 10 μL/pocillo del stock 2× de sustrato apropiado (que contiene 20 μM de ATP para los ensayos de PI3Kα y -β y que contiene 8 μM de ATP para los ensayos de PI3Kγ y -δ) a las columnas 1–24 de todas las placas. Luego, las placas se incuban a temperatura ambiente durante 20 min. En la oscuridad, se añaden 10 μL/pocillo de la solución de perlas donadoras a las columnas 1–24 de las placas para detener la reacción enzimática. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 min. Todavía en la oscuridad, se añaden 10 μL/pocillo de la solución de perlas aceptoras a las columnas 1–24 de las placas. Luego, las placas se incuban en la oscuridad durante 1,5 h. Las placas se leen en un lector de placas multimodo Envision usando un filtro de excitación de 680 nm y un filtro de emisión de 520–620 nm.

En ratas Lewis hembra, AMG319 (3 mg/kg, p.o.) inhibe la respuesta inflamatoria inducida por KLH en un 88 %. En los ratones transgénicos (IgMm), este compuesto (, p.o.) inhibe el pAKT in vivo con una IC50 de 1,9 nM. [1]