PNU-120596 AChR Modulador

PNU-120596 increases agonist (Ach)-evoked calcium flux mediated by an engineered variant of the human α7 nAChR. This compound increases agonists (choline and ACh)-evoked currents mediated by wild-type receptors and also demonstrates a pronounced prolongation of the evoked response in the continued presence of agonist in Xenopus oocytes. It increases the channel mean open time ofα7 nAChRs but has no effect on ion selectivity and relatively little, if any, effect on unitary conductance. When applied to acute hippocampal slices, this chemical increases the frequency of ACh-evoked GABAergic postsynaptic currents measured in pyramidal neurons; this effect is suppressed by TTX, suggesting that it modulates the function of α7 nAChRs located on the somatodendritic membrane of hippocampal interneurons. [1] Besides the positive modulation to α7 nAChR, this compound induces a profound retardation of the kinetics of desensitization, raising the potential of Ca²⁺-induced toxicity through excessive stimulation of α7 nAChR. [2] It causes changes in cysteine accessibility at the inner beta sheet, transition zone and agonist binding site while binding to α7 nAChR. Binding sites for this chemical are not in the agonist-binding sites and it enhances agonist-evoked gating of nicotinic receptors by eliciting conformational effects that are similar but nonidentical to the gating conformations promoted by Ach. [3]

Ensayo de fluorescencia de Ca²⁺

Células epiteliales humanas SH-EP1 que expresan una variante del α7 nAChR (α7^*) se cultivan en medio esencial mínimo (MEM) que contiene aminoácidos no esenciales suplementado con 10% de suero bovino fetal, L-glutamina, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 250 ng/mL de fungizona, 400 μg/mL de higromicina B y 800 μg/mL de geneticina. α7^* es una variante del α7 nAChR humano, con dos mutaciones puntuales en el primer dominio transmembrana (T230P y C241S) que permiten una alta expresión funcional en células SH-EP1 [Groppi VE, Wolfe ML, Berkenpas MB (2003) U.S. Patent 6,693,172 B1]. Las células se cultivan en una incubadora a 37 °C con 6% de CO₂. Las células se tripsinizan y se siembran en placas de 96 pocillos con paredes laterales oscuras y fondos claros a una densidad de 2 × 10⁴ células/pocillo 2 días antes del análisis. Las células se cargan con una mezcla de Calcium Green-1 AM en dimetilsulfóxido anhidro y 20% de Pluronic F-127. Este reactivo se añade directamente al medio de crecimiento de cada pocillo para alcanzar una concentración final de 2 μM de Calcium Green-1 AM. Luego, las células se incuban en el colorante durante 1 hora a 37 °C y luego se lavan cuatro veces con la solución salina equilibrada de Earle modificada de Mark (MMEBSS) compuesta de lo siguiente (en mM): 4 CaCl₂, 0,8 MgSO₄, 20 NaCl, 5,3 KCl, 5,6 D-glucosa, 20 Tris-HEPES y 120 N-metil-D-glucamina, pH 7,4. Después del cuarto ciclo, se permite que las células incuben a 37 °C durante al menos 10 minutos. El volumen final de MMEBSS en cada pocillo es de 100 μL y se añade atropina a todos los pocillos para una concentración final de 1 μM. Se configura un lector de placas de imágenes fluorométricas (FLIPR; Molecular Devices, Union City, CA) para excitar el Calcium Green a 488 nm usando 500 mW de potencia y leyendo la emisión de fluorescencia de >525 nm. Se usa una exposición de 0,5 segundos para iluminar cada pocillo. La fluorescencia se detecta usando un juego de diafragmas de 2,0 o 1,2. Después de 30 segundos de registro basal, se añaden los compuestos de prueba a cada pocillo de una placa de 96 pocillos en 50 μL de una solución madre 3 ×. En cada experimento, se utilizan cuatro pocillos como controles de vehículo (0,2% DMSO).

Systemic administration of PNU-120596 (1 mg/kg) to rats improves the auditory gating deficit caused by amphetamine, a model proposed to reflect a circuit level disturbance associated with schizophrenia. [1] When administered prior to Carrageenan, 30 mg/kg of this compound significantly blunts mechanical hyperalgesia and weight bearing deficits for up to 4 hours. This chemical attenuates the carrageenan-induced increase in levels of TNF-α and IL-6 within the hindpaw oedema, diclofenac only attenuated IL-6 levels. Established mechanical hyperalgesia induced by Carrageenan or CFA is also partially reversed by this agent. [4]