PNU-120596

Células epiteliales humanas SH-EP1 que expresan una variante del α7 nAChR (α7^*) se cultivan en medio esencial mínimo (MEM) que contiene aminoácidos no esenciales suplementado con 10% de suero bovino fetal, L-glutamina, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 250 ng/mL de fungizona, 400 μg/mL de higromicina B y 800 μg/mL de geneticina. α7^* es una variante del α7 nAChR humano, con dos mutaciones puntuales en el primer dominio transmembrana (T230P y C241S) que permiten una alta expresión funcional en células SH-EP1 [Groppi VE, Wolfe ML, Berkenpas MB (2003) U.S. Patent 6,693,172 B1]. Las células se cultivan en una incubadora a 37 °C con 6% de CO₂. Las células se tripsinizan y se siembran en placas de 96 pocillos con paredes laterales oscuras y fondos claros a una densidad de 2 × 10⁴ células/pocillo 2 días antes del análisis. Las células se cargan con una mezcla de Calcium Green-1 AM en dimetilsulfóxido anhidro y 20% de Pluronic F-127. Este reactivo se añade directamente al medio de crecimiento de cada pocillo para alcanzar una concentración final de 2 μM de Calcium Green-1 AM. Luego, las células se incuban en el colorante durante 1 hora a 37 °C y luego se lavan cuatro veces con la solución salina equilibrada de Earle modificada de Mark (MMEBSS) compuesta de lo siguiente (en mM): 4 CaCl₂, 0,8 MgSO₄, 20 NaCl, 5,3 KCl, 5,6 D-glucosa, 20 Tris-HEPES y 120 N-metil-D-glucamina, pH 7,4. Después del cuarto ciclo, se permite que las células incuben a 37 °C durante al menos 10 minutos. El volumen final de MMEBSS en cada pocillo es de 100 μL y se añade atropina a todos los pocillos para una concentración final de 1 μM. Se configura un lector de placas de imágenes fluorométricas (FLIPR; Molecular Devices, Union City, CA) para excitar el Calcium Green a 488 nm usando 500 mW de potencia y leyendo la emisión de fluorescencia de >525 nm. Se usa una exposición de 0,5 segundos para iluminar cada pocillo. La fluorescencia se detecta usando un juego de diafragmas de 2,0 o 1,2. Después de 30 segundos de registro basal, se añaden los compuestos de prueba a cada pocillo de una placa de 96 pocillos en 50 μL de una solución madre 3 ×. En cada experimento, se utilizan cuatro pocillos como controles de vehículo (0,2% DMSO).

SH-SY5Y-α7 cells

3-10 μM

24 hours

SH-SY5Y-α7 cells are plated on 96-well plates at a density of 15,000 cells per well (100 μL of 1.5 × 10⁵ cells per mL) in complete growth medium and placed into a 37 °C incubator for 20 to 24 hours. Complete growth medium then is replaced with experimental medium alone ("PNU-120596 free") or containing appropriate concentrations of this compound and returns to the 37 °C ncubator for 20 to 24 hours. The medium is then replaced with fresh experimental medium and 20 μL per well MTS solution and returned to the 37 °C incubator for 3 hours, after which the plate is read on a microplate spectrophotometer at an absorbance of 490 nm. For all data analysis, data are normalized to untreated compound-free wells (100% cell viability) and a background absorbance taken from wells containing experimental medium and MTS solution.

male Sprague Dawley rats (weighing 250–300 g)

1 mg/kg

PNU-120596 is intravenously administrated 5 minutes before auditory gating measurements.