Dyngo-4a (Hydroxy-Dynasore) Dynamin inhibidor

Dyngo-4a inhibe la endocitosis dependiente de dinamina de transferrina en múltiples tipos celulares con una IC₅₀ de 5,7 μM, y reduce la endocitosis de vesículas sinápticas y la endocitosis masiva dependiente de la actividad en neuronas cultivadas y sinaptosomas. [1] En terminales nerviosas motoras y neuronas hipocampales cultivadas, este compuesto bloquea la internalización de Alexa Fluor 488-BoNT/A-Hc. [2] En células S2R+ de Drosophila, causa una disminución en el nivel de Armadillo/β-catenina. [3]

Ensayo de GTPasa de dinamina

La actividad de la dinamina I se mide en su estado de actividad SAI o se estimula mediante tres métodos diferentes. Dado que cada estímulo activa la dinamina en diferentes grados, cada ensayo requiere diferentes concentraciones de dinamina. Primero, la actividad máxima de la dinamina se estimula mediante liposomas de PS sonicados. La dinamina I purificada (10–20 nM, diluida en: 6 mM Tris–HCl, 20 mM NaCl y 0,01% Tween 80, pH 7,4) se incuba en placas de 96 pocillos en tampón GTPasa (5 mM Tris–HCl, 10 mM NaCl, 2 mM Mg²⁺, 0,05% Tween 80, pH 7,4, 1 µg/mL leupeptina y 0,1 mM PMSF) y GTP 0,3 mM en presencia del compuesto de prueba durante 30 min a 37°C en un volumen de ensayo final de 150 μL. Las reacciones se terminan con 10 μL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M pH 7,4 y se añade solución de Verde Malaquita (40 μL: 2% p/v tetrahidrato de molibdato de amonio, 0,15% p/v verde malaquita y 4 M HCl) durante 5 min. En segundo lugar, la dinamina (20 nM) se estimula con 10 µg/mL de microtúbulos preformados de cerebro bovino estabilizados con taxol utilizando el mismo protocolo. En tercer lugar, la dinamina I (50 nM) se estimula con 1 μM de grb2 recombinante, una proteína que contiene SH3 y que estimula la dinamina de 5 a 10 veces menos eficientemente que los liposomas o los microtúbulos. Finalmente, la actividad SAI de la dinamina (500 nM) se mide utilizando altas concentraciones de dinamina, lo que promueve su autoensamblaje cooperativo en anillos (pero no en hélices). La concentración final de DMSO en los ensayos de GTPasa o endocitosis es como máximo del 3,3 o 1%, respectivamente, pero típicamente del 1%. El ensayo de GTPasa para la dinamina I no se ve afectado por el DMSO hasta un 3,3%. Los compuestos se disuelven como soluciones madre de 30 mM en 100% de DMSO. Estas soluciones madre pueden almacenarse a -20°C durante varios meses. Los compuestos se diluyen posteriormente en soluciones de 50% de DMSO preparadas en 20 mM Tris–HCl pH 7,4 y se diluyen de nuevo en el ensayo final. Para el análisis de la cinética de inhibición de este compuesto, la dinamina I a una concentración final de 17 nM se incuba con tampón GTPasa que contiene PS (2 µg/mL) y cantidades variables de GTP (50–250 μM) en presencia de este químico en un rango de concentración entre 0,5 y 6 μM. La reacción se detiene después de 30 min mediante la adición de EDTA (0,5 mM, pH 7,4). Las curvas se generan utilizando la ecuación de Michaelis–Menten v = Vmax[S]/(Km + [S]), donde S es el sustrato GTP. Después de determinar los valores de Vmax y Km, los datos se transformaron utilizando la ecuación de Lineweaver–Burke, 1/v = 1/Vmax + (Km/Vmax)(1/[S]). Las condiciones del ensayo se basan en el ensayo de dinamina I, pero contienen modificaciones. La dinamina II recombinante se utiliza a 50 nM, estimulada por 10 µg/mL de PS. La reacción de GTPasa se deja ocurrir durante 90 min a 37°C antes de la terminación.