Dyngo-4a (Hydroxy-Dynasore)

La actividad de la dinamina I se mide en su estado de actividad SAI o se estimula mediante tres métodos diferentes. Dado que cada estímulo activa la dinamina en diferentes grados, cada ensayo requiere diferentes concentraciones de dinamina. Primero, la actividad máxima de la dinamina se estimula mediante liposomas de PS sonicados. La dinamina I purificada (10–20 nM, diluida en: 6 mM Tris–HCl, 20 mM NaCl y 0,01% Tween 80, pH 7,4) se incuba en placas de 96 pocillos en tampón GTPasa (5 mM Tris–HCl, 10 mM NaCl, 2 mM Mg²⁺, 0,05% Tween 80, pH 7,4, 1 µg/mL leupeptina y 0,1 mM PMSF) y GTP 0,3 mM en presencia del compuesto de prueba durante 30 min a 37°C en un volumen de ensayo final de 150 μL. Las reacciones se terminan con 10 μL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M pH 7,4 y se añade solución de Verde Malaquita (40 μL: 2% p/v tetrahidrato de molibdato de amonio, 0,15% p/v verde malaquita y 4 M HCl) durante 5 min. En segundo lugar, la dinamina (20 nM) se estimula con 10 µg/mL de microtúbulos preformados de cerebro bovino estabilizados con taxol utilizando el mismo protocolo. En tercer lugar, la dinamina I (50 nM) se estimula con 1 μM de grb2 recombinante, una proteína que contiene SH3 y que estimula la dinamina de 5 a 10 veces menos eficientemente que los liposomas o los microtúbulos. Finalmente, la actividad SAI de la dinamina (500 nM) se mide utilizando altas concentraciones de dinamina, lo que promueve su autoensamblaje cooperativo en anillos (pero no en hélices). La concentración final de DMSO en los ensayos de GTPasa o endocitosis es como máximo del 3,3 o 1%, respectivamente, pero típicamente del 1%. El ensayo de GTPasa para la dinamina I no se ve afectado por el DMSO hasta un 3,3%. Los compuestos se disuelven como soluciones madre de 30 mM en 100% de DMSO. Estas soluciones madre pueden almacenarse a -20°C durante varios meses. Los compuestos se diluyen posteriormente en soluciones de 50% de DMSO preparadas en 20 mM Tris–HCl pH 7,4 y se diluyen de nuevo en el ensayo final. Para el análisis de la cinética de inhibición de este compuesto, la dinamina I a una concentración final de 17 nM se incuba con tampón GTPasa que contiene PS (2 µg/mL) y cantidades variables de GTP (50–250 μM) en presencia de este químico en un rango de concentración entre 0,5 y 6 μM. La reacción se detiene después de 30 min mediante la adición de EDTA (0,5 mM, pH 7,4). Las curvas se generan utilizando la ecuación de Michaelis–Menten v = Vmax[S]/(Km + [S]), donde S es el sustrato GTP. Después de determinar los valores de Vmax y Km, los datos se transformaron utilizando la ecuación de Lineweaver–Burke, 1/v = 1/Vmax + (Km/Vmax)(1/[S]). Las condiciones del ensayo se basan en el ensayo de dinamina I, pero contienen modificaciones. La dinamina II recombinante se utiliza a 50 nM, estimulada por 10 µg/mL de PS. La reacción de GTPasa se deja ocurrir durante 90 min a 37°C antes de la terminación.

αT3–1 or LβT2 cells

30 μM

30 minutes

αT3-1 or LβT2 cells (2 × 10⁶) were grown overnight in a 6-well culture dish and then serum starved for 2–4 hours. Cells were pretreated with either vehicle (0), dynasore (80μM), or dyngo (30μM) for 30 minutes. For dose-response studies, indicated doses of this compound were used for a 30-minute pretreatment. After pretreatment, cells were treated with 0 or GnRHa (10 nM) for 10 minutes. Cells were then washed twice in PBS, lysed in radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer and subjected to SDS-PAGE (acrylamide:bis-acrylamide ratio of 29:1) and electroblotted to polyvinylidene difluoride membranes.

Female CD-1 mice

30 mg/kg

i.p.