NH125 CaMK inhibidor

En células de glioma C6, NH125 disminuye el contenido celular de fosfo-eEF-2 sin afectar el contenido total de eEF-2, y bloquea el tránsito del ciclo celular en el límite G1-S. Este compuesto inhibe potentemente la viabilidad celular de 10 células cancerosas con una IC50 que oscila entre 0,7 y 4,8 μM. [1] Inhibe eficazmente las histidina proteína quinasas, incluyendo Envz, PhoQ, BvgS, EvgS, y por lo tanto produce potentes actividades antibacterianas contra Staphylococcus aureus resistente a oxacilina (ORSA), Enterococcus faecalis resistente a vancomicina (VRE), Streptococcus pneumoniae resistente a penicilina (PRS), y otras bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. [2] La inhibición de EEF2K por este químico hace que las células tumorales sean más sensibles a la curcumina y al velcade, que poseen acción inductora de estrés del RE. [3]

Ensayo de la eEF-2 Quinasa

La actividad de la eEF-2 quinasa se mide mediante dos métodos: (a) un ensayo basado en filtro; y (b) por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo antifosfo-eEF2. Para ambos, las reacciones se llevan a cabo en 20 μl de volumen total que contiene 50 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1,5 mM CaCl₂, 100 μg/ml de calmodulina, 2 μM de eEF-2 marcado con His y 400 nM de GST-eEF-2 quinasa, y mezcla de ATP [50 μM de ATP con 1 μCi (γ-³³P)ATP]. La mezcla de quinasa sin ATP se prepara en hielo y luego se preincuba durante 15 min a temperatura ambiente. Las reacciones de quinasa se inician añadiendo ATP y se dejan progresar a 30°C durante 30 min. Para el ensayo basado en filtro, la reacción se termina añadiendo 20 μl de ácido fosfórico frío al 1,5%, y 5 μl de la reacción se aplican a papel de fosfocelulosa P81 Whatman. El papel se lava tres veces en 500 ml de ácido fosfórico al 0,5% y una vez con 200 ml de acetona. Luego, el papel se seca al aire y se sumerge en 10 ml de mezcla de centelleo. La radioactividad se cuenta usando un contador de centelleo líquido Beckton-Dickinson. Para la inmunotransferencia, las reacciones se detienen añadiendo 20 μl de tampón Lamelli 3× [190 mM Tris (pH 6,8), 6% SDS, 30% glicerol, 15% 2-mercaptoetanol y 0,003% de colorante azul de bromofenol]. Las muestras se hierven durante 5 min y se resuelven mediante SDS-PAGE al 7% y se procesan para Western blotting como se describe a continuación. Las condiciones para ambos ensayos se eligen para asegurar la linealidad de la reacción con respecto al tiempo de incubación y la concentración de la enzima.

NH125 reduce la presión arterial en SHR y la producción de ROS, la inducción de moléculas inflamatorias y la hipertrofia en la arteria mesentérica superior de SHR. [4]