BX-912 PDK Inhibidor

BX912 prevents ChcK1, PKA, c-kit, and KDR with IC50 of 0.83, 0.11, 0.85, and 0.41 μM, resepectively. BX912 blocks PDK1/Akt signaling in tumor cells and suppresses the anchorage-dependent growth of a variety of tumor cell lines (such as PC-3 cells ) in culture or induces apoptosis. A number of cancer cell lines (such as MDA-468 breast cancer) with elevated Akt activity are >30-fold more sensitive to growth inhibition by PDK1 inhibitor BX912 in soft agar than on tissue culture plastic, consistent with the cell survival function of the PDK1/Akt signaling pathway, which is particularly important for unattached cells. BX912 potently blocks PDK1 enzyme activity in a direct kinase assay format, although BX912 fails to block preactivated AKT2 activity (IC50 > 10 μM). Therefore, BX-912 is a direct inhibitor of PDK1. BX912 is a competitive inhibitor of PDK1 activity with respect to its substrate, ATP, suggesting that BX912 binds to the ATP binding pocket of PDK1. The aminopyrimidine backbone of BX912 adopts a similar orientation in the active site of PDK1. BX912 promotes a pronounced increase in the population of MDA-468 cells with 4 N DNA content, indicative of a block at the G2/M phase of the cell cycle. BX912 also potently inhibits the growth of HCT-116 cells in soft agar, showing a 96% inhibitory effect at a dose of 1 μM. BX912 potently inhibits the growth of PC-3 cells in soft agar, displaying IC50 of 0.32 μM. [1]

Ensayos de quinasas

PDK1 se analiza en un ensayo de quinasa directo y en un formato de ensayo acoplado que mide la activación de AKT2 mediada por PDK1 y PtdIns-3,4-P2. Para el ensayo acoplado, la mezcla de ensayo final (60 μL) contenía: 15 mM MOPS, pH 7,2, 1 mg/mL de albúmina de suero bovino, 18 mM de β-glicerol fosfato, 0,7 mM de ditiotreitol, 3 mM de EGTA, 10 mM de MgOAc, 7,5 μM de ATP, 0,2 μCi de [γ- ³³P]ATP, 7,5 μM de sustrato peptídico biotinilado (biotin-ARRRDGGGAQPFRPRAATF), 0,5 μL de vesículas de fosfolípidos que contienen PtdIns-3,4-P2, 60 pg de PDK1 humana recombinante purificada y 172 ng de AKT2 humana recombinante purificada. Tras la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente, el péptido marcado con biotina se captura a partir de 10 μL de la mezcla de ensayo en perlas SPA recubiertas de estreptavidina, y la formación de producto se mide mediante centelleo por proximidad en un contador Wallac MicroBeta. El producto formado es proporcional al tiempo de incubación y a la cantidad de PDK1 y AKT2 inactiva añadida. La PDK1 se añade en niveles subóptimos para que el ensayo pueda detectar de forma sensible inhibidores de la activación de AKT2, así como el inhibidor directo BX-912 de PDK1 o AKT2. Para medir la actividad de PDK1 directamente, la mezcla de ensayo final (60 μL) contenía 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM de EGTA, 0,1 mM de EDTA, 0,1 % de β-mercaptoetanol, 1 mg/mL de albúmina de suero bovino, 10 mM de MgOAc, 10 μM de ATP, 0,2 μCi de [γ-³³P]ATP, 7,5 μM de péptido sustrato (H2N-ARRRGVTTKTFCGT) y 60 ng de PDK1 humana recombinante purificada. Tras 4 horas a temperatura ambiente, se añaden 25 mM de EDTA y se deposita una porción de la mezcla de reacción sobre papel de fosfocelulosa P81. El papel de filtro se lava tres veces con ácido fosfórico al 0,75 % y una vez con acetona. Tras el secado, el péptido marcado unido al filtro se cuantifica utilizando un fosforimager.