BX-912 PDK inhibidor

BX912 previene ChcK1, PKA, c-kit y KDR con IC50 de 0,83, 0,11, 0,85 y 0,41 , respectivamente. BX912 bloquea la señalización de PDK1/Akt en células tumorales y suprime el crecimiento dependiente del anclaje de una variedad de líneas celulares tumorales (como las células PC-3) en cultivo o induce la apoptosis. Varias líneas celulares cancerosas (como el cáncer de mama MDA-468) con actividad Akt elevada son >30 veces más sensibles a la inhibición del crecimiento por el inhibidor de PDK1 BX912 en agar blando que en plástico de cultivo tisular, lo que concuerda con la función de supervivencia celular de la vía de señalización PDK1/Akt, que es particularmente importante para las células no adheridas. BX912 bloquea potentemente la actividad enzimática de PDK1 en un formato de ensayo de quinasa directa, aunque BX912 no logra bloquear la actividad de AKT2 preactivada (IC50 > 10 ). Por lo tanto, BX-912 es un inhibidor directo de PDK1. BX912 es un inhibidor competitivo de la actividad de PDK1 con respecto a su sustrato, el ATP, lo que sugiere que BX912 se une al bolsillo de unión de ATP de PDK1. El esqueleto de aminopirimidina de BX912 adopta una orientación similar en el sitio activo de PDK1. BX912 promueve un aumento pronunciado en la población de células MDA-468 con contenido de ADN 4 N, lo que indica un bloqueo en la fase G2/M del ciclo celular. BX912 también inhibe potentemente el crecimiento de las células HCT-116 en agar blando, mostrando un efecto inhibidor del 96% a una dosis de 1 . BX912 inhibe potentemente el crecimiento de las células PC-3 en agar blando, mostrando una IC50 de 0,32 . [1]

Ensayos de quinasa

PDK1 se ensaya en un ensayo de quinasa directo y en un formato de ensayo acoplado que mide la activación de AKT2 mediada por PDK1 y PtdIns-3,4-P2. Para el ensayo acoplado, la mezcla de ensayo final (60 L) contenía: 15 mM MOPS, pH 7,2, 1 mg/mL de albúmina de suero bovino, 18 mM -glicerol fosfato, 0,7 mM ditiotreitol, 3 mM EGTA, 10 mM MgOAc, 7,5 M ATP, 0,2 Ci de [- ³³P]ATP, 7,5 M de sustrato peptídico biotinilado (biotin-ARRRDGGGAQPFRPRAATF), 0,5 L de vesículas fosfolipídicas que contenían PtdIns-3,4-P2, 60 pg de PDK1 humano recombinante purificado y 172 ng de AKT2 humano recombinante purificado. Después de la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente, el péptido marcado con biotina se captura de 10 L de la mezcla de ensayo en perlas SPA recubiertas de estreptavidina, y la formación del producto se mide por proximidad de centelleo en un contador Wallac MicroBeta. El producto formado es proporcional al tiempo de incubación y a la cantidad de PDK1 y AKT2 inactiva añadida. PDK1 se añade a niveles subóptimos para que el ensayo pueda detectar sensiblemente los inhibidores de la activación de AKT2, así como el inhibidor directo BX912 de PDK1 o AKT2. Para medir la actividad de PDK1 directamente, la mezcla de ensayo final (60 L) contenía 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 0,1 mM EDTA, 0,1% -mercaptoetanol, 1 mg/mL de albúmina de suero bovino, 10 mM MgOAc, 10 M ATP, 0,2 Ci de [- ³³P]ATP, 7,5 M de péptido sustrato (H2N-ARRRGVTTKTFCGT) y 60 ng de PDK1 humano recombinante purificado. Después de 4 horas a temperatura ambiente, se añaden 25 mM de EDTA y se detecta una porción de la mezcla de reacción en papel de fosfocelulosa P81. El papel de filtro se lava tres veces con 0,75% de ácido fosfórico y una vez con acetona. Después de secar, el péptido marcado unido al filtro se cuantifica utilizando un fósforoimager.