Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

Materiales requeridos (no incluidos)

• lector de microplacas (filtro de 450 nm)
• 10 μl, 100-200 μl y pipetas multicanal.
• 1 % SDS (opcional).

Procedimiento experimental

1) Inocular las células en un matraz o placa de cultivo celular y permitir que las células se adhieran o crezcan durante aproximadamente 4 a 24 horas antes de continuar con el ensayo.
2) Añadir 1/10 del volumen de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) directamente a las células en el medio de cultivo. Mezclar a fondo para lograr una solución homogénea golpeando ligeramente el exterior de la placa varias veces, evitando burbujas. Para una placa de 96 pocillos, añadir 10 µl de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) por cada 100 µl de medio de cultivo.
3) Incubar en un incubador de cultivo celular durante 0,5 a 4 horas a 37°C hasta que el color se vuelva naranja. Una incubación excesiva dará resultados falsos.
Nota: La sensibilidad de detección aumenta con tiempos de incubación más prolongados. Para muestras con menos células, use un tiempo de incubación más prolongado de hasta 24 horas.
4) Registrar los resultados usando un lector de microplacas para medir la absorbancia de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) a 450 nm. Los valores de DO recomendados oscilan entre 0,8-1,5; sin embargo, los valores entre 0,5-2,5 son aceptables.
Nota: Se produce una ligera absorbancia espontánea alrededor de 450 nm en el medio de cultivo incubado con Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Esta absorbancia de fondo depende del medio de cultivo, el pH, el tiempo de incubación y la duración de la exposición a la luz. La absorbancia de fondo típica después de 2 horas de incubación es de 0,1 a 0,2 unidades de absorbancia. Para corregir esto, prepare uno o más pocillos de control sin células y reste la absorbancia promedio de los pocillos de control de la de los otros pocillos.
5) Opcional: Añadir 10 μl de SDS al 1 % (disolver 0,1 g de SDS con tampón PBS para preparar 10 ml de solución) directamente a 100 μl de células para detener la reacción. Las señales pueden leerse en un plazo de 3 días sin afectar los valores de absorbancia.
6) Cálculo de la viabilidad celular:
Viabilidad celular (%)
A (Fármaco+) : valor de DO de los pocillos con células, CCK-8 y fármacos;
A (Fármaco-) : valor de DO de los pocillos con células, CCK-8, pero sin fármacos;
A (Blanco): valor de DO de los pocillos con medio de cultivo y CCK-8, pero sin células.

Breve resumen del protocolo

Aplicaciones

1) Determinaciones de la proliferación celular: el Selleck Cell Counting Kit-8 (CCK-8) es soluble en agua, estable en cultivo y no tóxico.
2) Ensayos de viabilidad celular: la actividad metabólica y la generación de colorante cambian en proporción a la viabilidad alterada.
3) Ensayos de citocinas: miden la proliferación inducida por citocinas. Las células pueden recuperarse y expandirse al final del estudio si se desea.
4) Ensayos de citotoxicidad: la muerte celular por productos químicos citotóxicos no tiene efectos sobre el desarrollo del color; solo las células vivas convierten el reactivo en un indicador colorimétrico. El reactivo en sí tiene una toxicidad insignificante y es generalmente seguro para las células.

Nota

1. El Cell Counting Kit-8 (CCK-8) es una solución lista para usar. Mezclar el reactivo para asegurar una solución homogénea antes de usar.
2. Si planea usar un tiempo de incubación más prolongado (durante la noche), asegúrese de mantener condiciones estériles durante la adición del reactivo y la incubación para evitar contaminantes microbianos. Los cultivos contaminados darán resultados erróneos, ya que los contaminantes microbianos también reducen el Cell Counting Kit-8 (CCK-8).
3. Asegúrese de incluir controles de ensayo apropiados. Para minimizar los errores experimentales, recomendamos realizar mediciones de un mínimo de 3 a 8 réplicas del control experimental y del control solo con medio.
4. Este producto es solo para uso en I+D, no para uso médico, doméstico u otros.