NVP-BSK805 2HCl JAK remmer

NVP-BSK805 blijkt JAK2 krachtig te remmen, terwijl het meer dan 20-voudige selectiviteit vertoont ten opzichte van JAK1, JAK3 en TYK2. NVP-BSK805 veroorzaakt een halfmaximale remming van full-length JAK2^V617F en JAK2 wild-type enzymen bij 0,5 nM. NVP-BSK805 blokkeert de groei van JAK2^V617F-cellen (Ba/F3) en induceert apoptose met een GI50 bij concentraties <100 nM. Omdat constitutieve STAT5-fosforylering afhankelijk is van JAK2, blijkt NVP-BSK805 de STAT5-fosforylering krachtig te onderdrukken bij ≥ 100 nM concentraties in de JAK2^V617F-mutante cellijnen, zoals MB-02. Incubatie van SET-2-cellen met 150 nM en 1 µM NVP-BSK805, wat respectievelijk overeenkomt met concentraties die 75% en 95% groeiremming opleveren, gedurende 24, 48 en 72 uur leidt tot concentratie- en tijdsafhankelijke inductie van apoptose. Deze resultaten worden bewezen door de detectie van gekliefd PARP, verminderde Bcl-xL-expressie en een sterke toename van het aantal cellen met minder dan 2N DNA-gehalte. [1] NVP-BSK805 getriggerde celdood vereist activering van caspasecascades en wordt overwonnen door caspase-inhibitie in zowel SET-2 als MB-02 cellen. NVP-BSK805 moduleert de post-translationele modificatie van Bim en de niveaus van Mcl-1 in JAK2^V617F cellen, SET-2 en MB-02 cellen. [2]

Enzymatische Assays

Het menselijke JAK2 kinase domein (aminozuren 840-1132) is opgenomen in plasmideconstruct pAcG2TtevJAK2. De plasmideconstructen voor JAK3 (813-1124), TYK2 (888-1187) en JAK1 (866-1154) zijn ontworpen. De generatie van de recombinante baculovirussen met BD BaculoGold^TM Bright gelineariseerd DNA, plaque-assay en virusamplificatie uit enkele plaques wordt uitgevoerd volgens de handleiding (BD Biosciences Pharmingen). Janus kinase domeinen worden tot expressie gebracht in Sf9-cellen in schudflessen van 400 mL met 100 mL ExCell420 kweekmedium (JRH Biosciences Ltd) met penicilline/streptomycine-oplossing gedurende 48 uur bij 27°C. Suspensiekweekcellen worden geïnfecteerd met een dichtheid van 1 × 10⁶ en de multipliciteit van infectie (MOI) voor elk virus wordt geoptimaliseerd voor de opbrengst van oplosbaar eiwit. Het kinasedomein van menselijk JAK2 en van JAK1, JAK3 en TYK2 wordt tot expressie gebracht met een MOI van respectievelijk 1 en 0,5. De expressietijd bij 27°C is 48 uur voor JAK2 en 48 uur of 72 uur voor JAK1, JAK3 en TYK2. Achtenveertig of tweeënzeventig uur na infectie worden de cellen van een 100 mL expressiekweek geoogst door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 5 minuten en gelyseerd met 12 mL lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM natriumorthovanadaat, 1 % Triton X-100, 10 % glycerol, 1 x EDTA-vrije complete protease-inhibitorcocktail (Roche Diagnostics) en 12.5 U/mL Benzonase gedurende 30 minuten bij 4°C, gevolgd door centrifugeren bij 14.000 × g gedurende 45 minuten om onoplosbaar materiaal af te pelletten. Voor GST-tag affiniteitszuivering van kinasedomeinproteïnen worden alle stappen uitgevoerd bij 4°C. De geklaarde lysaten worden geïncubeerd met 0,2 mL van een 50 % slurry van gewassen Glutathione Sepharose 4B gedurende 2 uur bij 4°C, gevolgd door 5 wasbeurten met 1 mL van 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100, 1 mM DTT en 10 % glycerol. Gebonden eiwit wordt geëlueerd in 5 aliquots, elk beginnend met een incubatie van 10 minuten met 0,25 mL elutiebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100, 1mM DTT, 10 % glycerol, 10 mM gereduceerd L-glutathion). Eluaten worden ongeveer 5-voudig geconcentreerd met Amicon Ultra-4 spinkolommen. Na toevoeging van Brij35 tot 0,1 % eindconcentratie wordt het eiwit snel bevroren in kleine aliquots en opgeslagen bij -80 °C. Onder deze omstandigheden zijn kinaseactiviteiten ten minste 6 maanden stabiel. De JAK kinasedomeenenzymen worden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd in een medium dat 0,1 μM [γ³³P]-ATP, 1 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂, 30 μM synthetisch peptidesubstraat EQEDEPEGDYFEWLE, 1 mM DTT, 1 % DMSO, 50 μg/mL BSA, 0.01 % Brij35 en 50 mM Tris-HCl pH 7.5 bevat. De ATP-concentratie ligt onder de Km voor alle eiwitten. Curves worden gefit door niet-lineaire regressie met behulp van de logistische vergelijking en de globale fitfunctie van XLfit® (model 205). Expressie en karakterisering van wild-type en V617F-mutant JAK2 van volledige lengte, evenals kinase-assaycondities zijn elders beschreven. Kinaseselectiviteit van NVP-BSK805 wordt beoordeeld in een intern kinasepanel: In de Caliper-assays worden kinase-reacties uitgevoerd met peptidesubstraten die met verschillende snelheden in een elektrisch veld migreren wanneer ze gefosforyleerd zijn. De peptiden dragen een fluorescerend label om de detectie en kwantificatie van de peptiden in een capillair systeem mogelijk te maken. Peptide fluorescentie-intensiteiten worden gekwantificeerd met behulp van het LC3000-instrument (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). Kinase-activiteit wordt gemeten door de hoeveelheid ATP die na een kinase-reactie in oplossing blijft te kwantificeren. In de LanthaScreen™ TR-FRET kinase-assays wordt terbium gebruikt als het lanthanidechelaat, gecombineerd met een antilichaam gericht tegen het gefosforyleerde substraat.

De orale biologische beschikbaarheid van NVP-BSK805 bij muizen wordt geschat op 45%, terwijl deze bij ratten 50% bedraagt. Orale toediening van NVP-BSK805 bij 150 mg/kg onderdrukt STAT5-fosforylering, splenomegalie en de verspreiding van leukemische cellen in een door Ba/F3 JAK2^V617F-cellen aangedreven muismodel. NVP-BSK805 onderdrukt rhEpo-geïnduceerde STAT5-fosforylering, evenals rhEpo-gemedieerde polycytemie en splenomegalie bij BALB/c-muizen in doses van 25, 50 en 100 mg/kg oraal. [1]