WYE-687

N.º de catálogoS2668 Lote:S266801

Datos técnicos

Fórmula	C₂₈H₃₂N₈O₃
Peso molecular	528.61	Número CAS	1062161-90-3
Solubilidad (25°C)*	In vitro	5%TFA	3.04 mg/mL (5.75 mM)
		DMSO	0.5 mg/mL (0.94 mM)
		Water	Insoluble
* <1 mg/ml significa ligeramente soluble o insoluble. * Tenga en cuenta que Selleck prueba la solubilidad de todos los compuestos internamente, y la solubilidad real puede diferir ligeramente de los valores publicados. Esto es normal y se debe a ligeras variaciones entre lotes. * Envío a temperatura ambiente (Las pruebas de estabilidad demuestran que este producto se puede enviar sin medidas de refrigeración.)

Preparación de soluciones madre

Actividad biológica

Descripción

WYE-687 es un inhibidor ATP-competitivo y selectivo de mTOR con una IC50 de 7 nM; este compuesto bloquea mTORC1/pS6K(T389) y mTORC2/P-AKT(S473) pero no se observa ningún efecto sobre P-AKT(T308). La selectividad por mTOR es mayor que por PI3Kα (>100 veces) y PI3Kγ (>500 veces).

Objetivos

mTOR

7 nM

In vitro

El ensayo de quinasa de inmunocomplejos muestra que el sustrato específico de mTORC2 His6-AKT o el sustrato de mTORC1 His6-S6K son inhibidos de forma dosis-dependiente por WYE-687. Este compuesto inhibe globalmente la señalización de mTOR y la función de AKT en modelos celulares de forma dosis-dependiente. Inhibe profundamente la síntesis de proteínas global y dependiente de la caperuza en células MDA361, células de cáncer de mama humano. Este químico muestra efectos antiproliferativos en varias líneas celulares cancerosas, incluyendo la detención del ciclo celular en G1 y la apoptosis selectiva. Reduce la regulación de los factores angiogénicos, VEGF y HIF-1α, en células U87MG, MDA361 y LNCap.

Protocolo (de referencia)

Ensayo de quinasa:^{^[1]}	Formato DELFIA de FLAG-TOR purificado Los ensayos de rutina con FLAG-TOR purificado (FL y 3.5) se realizan en placas de 96 pocillos de la siguiente manera. Las enzimas se diluyen primero en tampón de ensayo de quinasa (10 mM Hepes (pH 7.4), 50 mM NaCl, 50 mM β-glicerofosfato, 10 mM MnCl₂, 0.5 mM DTT, 0.25 μM microcistina LR y 100 μg/mL BSA). En cada pocillo, se mezclan brevemente 12 μL de la enzima diluida con 0.5 μL del inhibidor de prueba o vehículo de control dimetilsulfóxido (DMSO). La reacción de quinasa se inicia añadiendo 12.5 μL de tampón de ensayo de quinasa que contiene ATP y His6-S6K para obtener un volumen de reacción final de 25 μL que contiene 800 ng/mL de FLAG-TOR, 100 μM de ATP y 1.25 μM de His6-S6K. La placa de reacción se incuba durante 2 horas (lineal de 1 a 6 horas) a temperatura ambiente con agitación suave y luego se termina añadiendo 25 μL de tampón de parada (20 mM Hepes (pH 7.4), 20 mM EDTA y 20 mM EGTA). La detección DELFIA del His6-S6K fosforilado (Thr-389) se realiza a temperatura ambiente utilizando un anticuerpo monoclonal anti-P(T389)-p70S6K (1A5) marcado con Europio-N1-ITC (Eu) (10.4 Eu por anticuerpo). Cuarenta y cinco microlitros de la mezcla de reacción de quinasa terminada se transfieren a una placa MaxiSorp que contiene 55 μL de PBS. Se deja que el His6-S6K se adhiera durante 2 horas, después de lo cual los pocillos se aspiran y se lavan una vez con PBS. Se añaden cien microlitros de tampón DELFIA con 40 ng/mL de anticuerpo Eu-P(T389)-S6K. La unión del anticuerpo se continúa durante 1 hora con agitación suave. Los pocillos se aspiran y se lavan cuatro veces con PBS que contiene 0.05% de Tween 20 (PBST). Se añaden cien microlitros de solución de mejora DELFIA a cada pocillo y las placas se leen en un lector de placas modelo PerkinElmer Victor. Los datos obtenidos se utilizan para calcular la actividad enzimática y la inhibición enzimática por posibles inhibidores.
Ensayo celular:^{^[1]}	Líneas celulares MDA361, U87MG, HCT116, LNCap and HT29 cells Concentraciones 0-100 μM Tiempo de incubación 24 or 48 hours Método For cell cycle analysis, cells are seeded in 96-well culture plates at 10,000 cells per well for 24 hours, treated with various inhibitors for 24 hours or 48 hours. Following treatment, cells are harvested, washed with PBS and fixed overnight at -20 °C in 70% ethanol. Cells are washed, stained with propidium iodide and analyzed for cell cycle profile (acquired 5000 cells/well) on Guava PCA-96 instrument according to the Guava Cell Cycle Protocol

Ensayo de quinasa:^{^[1]}

Formato DELFIA de FLAG-TOR purificado
Los ensayos de rutina con FLAG-TOR purificado (FL y 3.5) se realizan en placas de 96 pocillos de la siguiente manera. Las enzimas se diluyen primero en tampón de ensayo de quinasa (10 mM Hepes (pH 7.4), 50 mM NaCl, 50 mM β-glicerofosfato, 10 mM MnCl₂, 0.5 mM DTT, 0.25 μM microcistina LR y 100 μg/mL BSA). En cada pocillo, se mezclan brevemente 12 μL de la enzima diluida con 0.5 μL del inhibidor de prueba o vehículo de control dimetilsulfóxido (DMSO). La reacción de quinasa se inicia añadiendo 12.5 μL de tampón de ensayo de quinasa que contiene ATP y His6-S6K para obtener un volumen de reacción final de 25 μL que contiene 800 ng/mL de FLAG-TOR, 100 μM de ATP y 1.25 μM de His6-S6K. La placa de reacción se incuba durante 2 horas (lineal de 1 a 6 horas) a temperatura ambiente con agitación suave y luego se termina añadiendo 25 μL de tampón de parada (20 mM Hepes (pH 7.4), 20 mM EDTA y 20 mM EGTA). La detección DELFIA del His6-S6K fosforilado (Thr-389) se realiza a temperatura ambiente utilizando un anticuerpo monoclonal anti-P(T389)-p70S6K (1A5) marcado con Europio-N1-ITC (Eu) (10.4 Eu por anticuerpo). Cuarenta y cinco microlitros de la mezcla de reacción de quinasa terminada se transfieren a una placa MaxiSorp que contiene 55 μL de PBS. Se deja que el His6-S6K se adhiera durante 2 horas, después de lo cual los pocillos se aspiran y se lavan una vez con PBS. Se añaden cien microlitros de tampón DELFIA con 40 ng/mL de anticuerpo Eu-P(T389)-S6K. La unión del anticuerpo se continúa durante 1 hora con agitación suave. Los pocillos se aspiran y se lavan cuatro veces con PBS que contiene 0.05% de Tween 20 (PBST). Se añaden cien microlitros de solución de mejora DELFIA a cada pocillo y las placas se leen en un lector de placas modelo PerkinElmer Victor. Los datos obtenidos se utilizan para calcular la actividad enzimática y la inhibición enzimática por posibles inhibidores.

Ensayo celular:^{^[1]}

Líneas celulares
MDA361, U87MG, HCT116, LNCap and HT29 cells
Concentraciones
0-100 μM
Tiempo de incubación
24 or 48 hours
Método
For cell cycle analysis, cells are seeded in 96-well culture plates at 10,000 cells per well for 24 hours, treated with various inhibitors for 24 hours or 48 hours. Following treatment, cells are harvested, washed with PBS and fixed overnight at -20 °C in 70% ethanol. Cells are washed, stained with propidium iodide and analyzed for cell cycle profile (acquired 5000 cells/well) on Guava PCA-96 instrument according to the Guava Cell Cycle Protocol

Referencias

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=WYE-687

Validación de productos por parte del cliente

: , , J Hepatol, 2016, 64(3):609-17.

Sellecks WYE-687 Ha sido citado por 1 Publicación

Laminin-332 sustains chemoresistance and quiescence as part of the human hepatic cancer stem cell niche [Govaere O, et al. J Hepatol, 2015, 10.1016/j.jhep.2015.11.011]	PubMed: 26592953

Laminin-332 sustains chemoresistance and quiescence as part of the human hepatic cancer stem cell niche [Govaere O, et al. J Hepatol, 2015, 10.1016/j.jhep.2015.11.011]

PubMed: 26592953

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