Wortmannin (SL-2052)

La inhibición de MLCK por Wortmannina no se ve afectada por la calmodulina ni el substrato peptídico, mientras que se reduce por una alta concentración de ATP. Este compuesto interactúa directamente con el dominio catalítico de MLCK y conduce a una pérdida irreversible de la actividad enzimática. No tiene efecto inhibidor sobre la proteína quinasa dependiente de cAMP, la proteína quinasa dependiente de cGMP y la proteína quinasa II dependiente de calmodulina, y tiene poco efecto sobre la actividad de la proteína quinasa C. [1]

Este inhibidor inhibe la formación de PtdInsP3 (fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato) estimulada por N-formilmetionil-leucilfenilalanina (fMLP) con una IC50 de 5 nM y esta inhibición se anula completamente cuando se pretrata con 100 nM de este compuesto en neutrófilos humanos, con niveles aumentados de PtdInsP2 y sin efectos sobre los contenidos celulares de PtdInsP y PtdIns. Podría desarrollar cambios oscilatorios en el contenido de F-actina y no inhibe la polimerización de actina estimulada por fMLP en neutrófilos. [2]

Este químico inhibe irreversiblemente la actividad de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3-quinasa) uniéndose a la proteína de 110-kDa (IC50 de 3 nM) y no tiene efecto sobre la PI4-quinasa en células RBL-2H3. También inhibe la liberación de leucotrienos, sin efecto sobre la activación de la tirosina quinasa Lyn. [3]

Este compuesto anula completamente la captación de hexosa inducida en adipocitos de rata aislados a 0.1 μM, sin afectar la actividad lipolítica estimulada. [4]

Suprime la producción inducida de óxido nítrico en un 50% a 500 nM en células endoteliales de vena umbilical humana, lo que responde al IGF-1. [5]

Este químico suprime la reparación de rupturas de doble hebra de ADN (DSB) y no tiene efecto sobre los niveles de DSB o la cinética de reparación de rupturas de hebra simple (SSB) en células de ovario de hámster chino a 50 μM. Podría potenciar la citotoxicidad inducida por radiación ionizante (IR) sin toxicidad por sí mismo. [6]

Este inhibidor inhibe la actividad de la polo-like kinase (PLK1) con una IC50 de 24 nM en células intactas arrestadas en G2/M. [7]

Aumenta la acumulación de IL-6 mediada por el receptor tipo Toll (TLR) en macrófagos humanos con una EC50 de 50 nM. Mientras tanto, este compuesto mejora significativamente la expresión de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) mediada por TLR y la acumulación de nitrito en macrófagos de ratón. Activa el factor nuclear-κB y regula al alza la producción de ARNm de citoquinas. [8]

Este químico también inhibe Polo-like kinase (PlK) 1 y PlK3, que desempeñan papeles importantes en la mitosis. Su tratamiento podría llevar a una reducción en la fosforilación de p53 en serina 20 inducida por daño en el ADN. [9]

Suprime la fosforilación de Akt inducida por hialuronano y la motilidad/migración celular en células SW1990. [10]

La Wortmannina inhibe la metástasis peritoneal de SW1990 en ratones a 1 mg/kg, sin pérdida de peso. [10]

Este compuesto inhibe la fosforilación de fosfatidilinositida 3-quinasa-proteína quinasa B (PKB)/Akt tanto en tejidos normales (homogenados de pulmón, corazón y cerebro) como en tejido tumoral en ratones, sin mortalidad ni toxicidad aguda a 0.7 mg/kg. En combinación con LY188011, este químico aumenta significativamente la apoptosis e inhibe el crecimiento tumoral en tumores ortotópicos, mientras que ambas monoterapias no pudieron. [11]

• Ensayo de MLCK

  La actividad de la MLCK se ensaya con un sustrato peptídico (KKRPQRATSNVFS-NH₂) o la cadena ligera de miosina. El sustrato peptídico (24 μM) se fosforila en una mezcla de reacción que contiene 25 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 0.5 mg/mL de albúmina sérica bovina, 4 mM de MgCl₂, 0.5 mM de CaCl₂, 2.6 nM de calmodulina, 1.5 nM de MLCK y 400 μM de ATP en un volumen final de 0.25 mL. Después de una preincubación de 10 min a 28 ºC sin ATP, la reacción se inicia mediante la adición de ATP a 28 ºC y se termina mediante la adición de 0.1 mL de ácido acético al 10% (v/v) después de 30 min. La mezcla se analiza mediante cromatografía líquida de alta resolución: columna, Unisil Pack 5C18 4.6 X 150 mm; disolvente, 18% (v/v) de acetonitrilo, 0.1% (v/v) de ácido trifluoroacético en agua; caudal, 1.0 mL/min; temperatura, 40 ºC; detección, absorbancia a 220 nm. El porcentaje de reacción se calcula a partir de la relación de las áreas de los picos de la forma fosforilada respecto a las de la forma no fosforilada. La actividad específica medida bajo las condiciones descritas anteriormente es de 0.81 μmol/min/mg. La cadena ligera de miosina (108 μg/mL) se fosforila en una mezcla de reacción que contiene 25 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 0.5 mg/mL de albúmina sérica bovina, 4 mM de MgCl₂, 0.5 mM de CaCl₂, 4.2 nM de calmodulina, 0.92 nM de enzima y 10 μM de [γ-³²P]ATP (100-900 cpm/pmol) en un volumen final de 0.25 mL. Después de una preincubación de 3 min a 30 ºC sin ATP, la reacción se inicia mediante la adición de [γ-³²P]ATP a 30 ºC y se detiene mediante la adición de 0.125 mL de ácido tricloroacético después de 5 min. Los materiales precipitables con ácido se recogen en un filtro de membrana de nitrocelulosa y se lavan con cuatro alícuotas de 1 mL de ácido tricloroacético al 5% (v/v). La radioactividad en el filtro se mide en un fluido de centelleo de tolueno, utilizando un espectrómetro de centelleo líquido Packard Tri-Carb Modelo 4530. La actividad específica medida bajo estas condiciones es de 1.23 μmol/min/mg. [1]

• Líneas celulares

  NK cells

• Concentraciones

  1 μM

• Tiempo de incubación

  1 h

• Método

  Primary NK cells were pretreated with wortmannin (1 μM) for 1 h, washed twice with RPMI 1640, and then treated with IL-15 (10 ng/mL) for 24 h. DMSO was used as control.

• Modelos animales

  Human pancreatic adenocarcinoma cells PK1 are injected both s.c. and orthotopically into SCID mice.

• Dosificaciones

  0.175, 0.35, and 0.7 mg/kg

• Administración

  Injected by i.v.