Vadimezan (DMXAA)

La actividad de la enzima DT-diaforasa purificada se ensaya midiendo la reducción del citocromo c a 550 nm en un espectrofotómetro Beckman DU 650. Cada ensayo contiene citocromo c (70 μM), NADH (concentraciones variables), DT-diaforasa purificada (0,032 μg) y menadiona (concentraciones variables) en un volumen final de 1 mL de tampón Tris–HCl (50 mM, pH 7,4) que contiene 0,14 % de BSA. La reacción se inicia con la adición de NADH. Las tasas de reducción se calculan sobre la parte inicial de la curva de reacción (30 segundos), y los resultados se expresan en términos de μmol de citocromo c reducido/min/mg de proteína utilizando un coeficiente de extinción molar de 21,1 mM⁻¹ cm⁻¹ para el citocromo c reducido. Los ensayos enzimáticos se llevan a cabo a temperatura ambiente y todas las reacciones se realizan por triplicado. La inhibición de la actividad de la DT-diaforasa purificada se realiza mediante la inclusión de Vadimezan (DMXAA) a varias concentraciones en la reacción, y las características de inhibición se determinan variando la concentración de NADH (menadiona constante) o menadiona (NADH constante) a varias concentraciones de este compuesto. Los valores de K_i se obtienen trazando 1/V frente a. La actividad de la DT-diaforasa en células DLD-1 se determina midiendo la reducción sensible al dicumarol de DCPIP a 600 nm. Brevemente, las células DLD-1 en crecimiento exponencial medio se cosechan raspando en tampón frío (Tris–HCl, 25 mM, pH 7,4 y 250 mM de sacarosa) y se sonicaron en hielo. Las condiciones del ensayo enzimático son 2 mM de NADH, 40 μM de DCPIP, 20 μL de dicumarol (cuando sea necesario) en un volumen final de 1 mL de Tris–HCl (25 mM, pH 7,4) que contiene BSA (0,7 mg/mL). Los resultados se expresan como la reducción de DCPIP sensible al dicumarol utilizando un coeficiente de extinción molar de 21 mM⁻¹ cm⁻¹. Los niveles de proteína se determinan utilizando el ensayo de Bradford.

DLD-1 and H460 cells

0-2 mM

96 hours

DLD-1 human colon carcinoma and H460 human non-small cell lung carcinoma cells are routinely maintained as monolayer cultures in RPMI 1640 culture medium supplemented with foetal calf serum (10%), sodium pyruvate (2 mM), penicillin/streptomycin (50 IU mL⁻¹/50 μg mL^-1) and l-glutamine (2 mM). Chemosensitivity is assessed using the MTT assay and all assays are performed under aerobic conditions. Briefly, cells are plated into each well of a 96-well culture plate and incubated overnight in an atmosphere containing 5% CO₂. Culture medium is completely removed from each well and replaced with medium containing a range of drug concentrations. In the case of menadione alone, the duration of drug exposure is 1 hour, after which the cells are washed twice with Hanks' balanced salt solution prior to the addition of 200 μL fresh RPMI 1640 medium to each well of the plate. For Vadimezan (DMXAA) alone, the duration of exposure is 3 hours. Following a four-day incubation, cell survival is determined using the MTT assay. For combinations of this compound with menadione, cells are initially set up and a non-toxic (>95% cell survival) concentration of it is selected. Cells are then initially exposed to DMXAA (2 mM) for a period of 2 hours, following which the medium is removed and replaced with medium containing the inhibitor (at a constant concentration of 2 mM) and menadione (at a range of drug concentrations). Following a further 7-hour incubation, cells are washed twice with Hanks' balanced salt solution prior to the addition of growth medium.

Chemical carcinogen (NMU) is injected into female Wistar rats.

≤300 mg/kg

Administered via i.p.