UNC1999

Los ensayos de actividad de metiltransferasa se realizan monitoreando la incorporación de grupos metilo marcados con tritio de S-adenosilmetionina (3H-SAM) a sustratos peptídicos biotinilados usando el Ensayo de Proximidad por Centelleo (SPA) para el complejo trimérico PRC2-EZH2 (EZH2:EED:SUZ12), el complejo pentamérico PRC2-EZH1 (EZH1:EED:SUZ12:RBBP4:AEBP2), SETD7, G9a, GLP, SETDB1, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, SUV39H2, el complejo tetramérico MLL1 (MLL:WDR5:RbBP5:ASH2L), PRMT1, PRMT3, el complejo PRMT5-MEP50 y SMYD2. El tampón de reacción para SMYD2 y SMYD3 es 50 mM Tris pH 9.0, 5 mM DTT, 0.01% TritonX-100; para G9a, GLP y SUV39H2 es 25 mM fosfato de potasio pH 8.0, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl₂ y 0.01% Triton X-100; y para otras HMTs 20 mM Tris pH 8.0, 5 mM DTT, 0.01% TritonX-100. Para detener las reacciones enzimáticas, se añaden 10 μL de clorhidrato de guanidina 7.5 M, seguido de 180 μL de tampón, se mezcla y se transfiere a una FlashPlate de 384 pocillos. Después de mezclar, las mezclas de reacción se incuban y los recuentos de CPM se miden usando un lector de placas Topcount. Los recuentos de CPM en ausencia de este compuesto para cada conjunto de datos se definen como 100% de actividad. En ausencia de la enzima, los recuentos de CPM en cada conjunto de datos se definen como fondo (0%). Los valores de IC50 se determinan usando concentraciones de compuesto que van desde 100 nM hasta 100 μM. Los valores de IC50 se determinan usando el software SigmaPlot. Los ensayos de EZH2-Y641F se realizan usando 30 nM de enzima en 20 mM Tris pH 8, 5 mM DTT, 0.01% Triton X-100, 5 μM SAM y 1 μM de péptido H3 (1-24) (igual que para el complejo PRC2-EZH2 de tipo salvaje). Para DNMT1, el ensayo se realiza usando dsDNA hemimetilado como sustrato. El sustrato de dsDNA se prepara por anillado de dos cadenas complementarias (cadena directa biotinilada: BGAGCCCGTAAGCCCGTTCAGGTCG y cadena inversa: CGACCTGAACGGGCTTACGGGCTC), sintetizadas por Eurofins MWG Operon. El tampón de reacción es 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5mM DTT, 0.01% Triton X-100. Los ensayos de actividad de metiltransferasa para DOT1L se realizan usando placas de filtro. Las mezclas de reacción en 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM DTT, 2 mM MgCl₂ y 0.01% Triton X-100 se incuban a temperatura ambiente durante 1h, se añaden 100 μL de TCA al 10%, se mezclan y se transfieren a una placa de filtro. Las placas se centrifugan a 2000 rpm durante 2 min seguido de 2 lavados adicionales con TCA al 10% y un lavado con etanol (180 μL) seguido de centrifugación. Las placas se secan y se añaden 100 μL de MicroO y se centrifugan. Se añaden 70 μL de MicroO y se miden los CPM usando un lector de placas Topcount.

DLBCL cell line harboring the EZH2Y641N mutant

~5 μM

8 days

DB cells, a diffuse-large B-cell lymphoma cell line harboring the EZH2 Y641N mutation, are obtained from ATCC and cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, antibiotics, and various concentrations of compounds (DMSO control, UNC1999, or UNC2400). The medium containing the test compound or control is refreshed every 3 days. The numbers of viable cells from at least three independent experiments are measured using TC20 automated cell counter system. Total histones are prepared from cell nuclei using an acidic extraction protocol. About 1 μg of total histones is separated using 15% SDS-PAGE, transferred to PVDF membranes, and probed with histone antibodies. Antibodies used in this study are those against EZH2, general H3, and H3K27me3.

Male Swiss albino mice

~150 mg/kg (i.p.), ~50 mg/kg (oral)

Intraperitoneal administration or oral administration