TPCA-1

En un ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo, TPCA-1 inhibe la actividad de la IKK-2 humana con una IC50 de 17,9 nM. Además, se demuestra que este compuesto es competitivo con el ATP. Asimismo, exhibe valores de IC50 de 400 nM y 3600 nM contra IKK-1 y JNK3, respectivamente. Este químico inhibe la producción de TNF-α, IL-6 e IL-8 de manera dependiente de la concentración, exhibiendo valores de IC50 de 170, 290 y 320 nM, respectivamente. [1] Inhibe la proliferación de células de glioma, así como la translocación nuclear de RelA (p65) inducida por TNF y la expresión génica de IL8 dependiente de NFκB. Es importante destacar que este compuesto inhibe la expresión génica inducida por IFN, suprimiendo completamente la expresión génica de MX1 y GBP1, mientras que solo tiene un efecto menor sobre la expresión de ISG15. [2]

La administración profiláctica de TPCA-1 a 3, 10 o 20 mg/kg, i.p., dos veces al día (b.i.d.), resulta en una reducción dosis-dependiente de la gravedad de la artritis murina inducida por colágeno (CIA). La reducción significativa de la gravedad de la enfermedad y el retraso en el inicio de la enfermedad resultantes de la administración de este compuesto a 10 mg/kg, i.p., dos veces al día (b.i.d.) son comparables a los efectos del fármaco antirreumático, i.p., cada dos días. La localización nuclear de p65, así como los niveles de IL-1beta, IL-6, TNF-alpha e interferón-gamma, se reducen significativamente en el tejido de la pata de los ratones tratados con este compuesto. Además, la administración in vivo de esta sustancia química resulta en una disminución significativa de la proliferación de células T inducida por colágeno ex vivo. La administración terapéutica de este compuesto a 20 mg/kg, pero no a 3 o 10 mg/kg, i.p., dos veces al día (b.i.d.), reduce significativamente la gravedad de la CIA. [1]

• Ensayo de IKK-2

  La IKK-2 humana recombinante (residuos 1-756) se expresa en baculovirus como una proteína de fusión con etiqueta GST N-terminal, y su actividad se evalúa utilizando un ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo. En resumen, IKK-2 (5 nM final) diluida en tampón de ensayo (50 mM HEPES, 10 mM MgCl₂, 1 mM CHAPS, pH 7,4, con 1 mM DTT y 0,01 % p/v BSA) se añade a los pocillos que contienen varias concentraciones de este compuesto o vehículo DMSO (3 % final). La reacción se inicia mediante la adición de sustrato GST-IκBα (25 nM final)/ATP (1 μM final), en un volumen total de 30 μL. La reacción se incuba durante 30 min a temperatura ambiente, luego se termina mediante la adición de 15 μL de EDTA 50 mM. Se añade el reactivo de detección (15 μL) en tampón (100 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl y 0,1 % p/v BSA) que contiene el anticuerpo monoclonal antiphosphoserine-IκBα-32/36 12C2, marcado con quelato de europio W-1024, y un anticuerpo anti-GST marcado con aloficocianina, y la reacción se incuba durante 60 min adicionales a temperatura ambiente. El grado de fosforilación de GST-IκBα se mide como una relación de la señal específica de transferencia de energía de 665 nm a la señal de referencia de europio de 620 nm, utilizando un lector de placas Packard Discovery.

• Líneas celulares

  U87, MT330, SJ-G2, and GBM6 human glioma lines

• Concentraciones

  0-50 μM

• Tiempo de incubación

  3 days

• Método

  Ten microliters of MTT from stock solution (10 mg/mL) is added to each well of 96-well plates containing glioma cells and incubated at 37 °C for 2–4 h. Oxidized MTT is solubilized by adding 100 μL of 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) in 0.01 N HCL, and plates are incubated at 37 °C for 4 h in a humidified chamber. Plates are read at 570 nm on a plate reader.

• Modelos animales

  Murine collagen-induced arthritis

• Dosificaciones

  3, 10, or 20 mg/kg

• Administración

  Administered via i.p. or b.i.d.