Dubermatinib(TP-0903)

En células de cáncer de páncreas (PSN-1), Dubermatinib (TP-0903) muestra una fuerte actividad antiproliferativa con una IC50 de 6 M. También induce un fuerte arresto en G2/M al inhibir potentemente Aurora A y B. [1] En células B de LLC de todos los pacientes con LLC, este compuesto provoca una inducción dosis-dependiente de apoptosis masiva al dirigirse a Axl fosforilado, y supera la protección mediada por BMSC de LLC de las células B de LLC contra la apoptosis. [2]

En el hipocampo de rata adulta, la administración intracerebroventricular de Dubermatinib (TP-0903) (2,5 nM) aumenta significativamente el número de células recién generadas y prolonga la supervivencia de las células del hipocampo. [3] En ratones, este compuesto (20 μg/g, i.p.) previene eficazmente las anomalías del desarrollo cerebeloso neonatal inducidas por GC. [4]

• Ensayo de actividad de la Axl Kinasa

  Los compuestos de prueba se diluyen a las concentraciones deseadas en tampón de reacción de la cinasa (50 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl², 1 mM EGTA, 2 mM DTT, y 0.01% v/v Tween-20) y se incuban brevemente con la cinasa Axl. La cinasa Axl utilizada es la cinasa Axl humana recombinante (dominio catalítico, aminoácidos 473-894) con una etiqueta de histidina. La reacción se inicia con la adición de ATP y sustrato poli-GT marcado (poli Glu:Tyr, polímero 4:1). La concentración de los diversos componentes en el ensayo (volumen de reacción de 10 µL) es: 1% DMSO, 93 ng/mL de cinasa Axl, 20 µM de ATP y 200 nM de sustrato poli-GT. Después de la adición de ATP y sustrato poli-GT, la incubación es de 60 min a temperatura ambiente, la reacción enzimática se detiene con la adición de 10 µL de anticuerpo anti-fosfotirosina PY20 marcado con terbio en tampón que contiene EDTA. La concentración final de EDTA y anticuerpo después de la adición a la reacción es de 10 mM y 2 nM, respectivamente. El anticuerpo conjugado con terbio genera una señal FRET resuelta en el tiempo con la molécula (unida al sustrato poli-GT) cuando el sustrato está fosforilado. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, la fluorescencia se mide con una excitación de 320 nm y una doble emisión de 495 y 520 nm en un lector de microplacas EnVision. La señal se expresa en términos de una relación TR-FRET (intensidad de fluorescencia a 520 nm con respecto a 495 nm).

• Líneas celulares

  PSN-1 cells

• Concentraciones

  --

• Tiempo de incubación

  96 hours

• Método

  For cell proliferation assays with Dubermatinib(TP-0903), 45 µL containing 1000 cells per well are seeded into solid white 384-well plates in appropriate cell growth media containing 10% FBS and incubated overnight at 37 °C and 5% CO₂. The following day, this compound is diluted in serum free growth media to 10x desired concentrations and 5 µL is added to each well. Combined compound and cells are incubated for 96 hours. Following incubation, 40 µL of ATP-Lite solution is added to each well, incubated for an additional 10 minutes at room temperature and luminescence is measured on an EnVision microplate reader. Percent cell viability for it is calculated by comparing treated wells to appropriate controls (e.g. vehicle treated) included on each plate.