Tiplaxtinin (PAI-039)

El ensayo cromogénico se inicia con la adición de Tiplaxtinin (PAI-039) (concentración final de 10 a 100 µM, concentración máxima de DMSO del 0,2%) a PAI-1 humano recombinante (140 nM en tampón pH 6,6). Después de una incubación de 15 minutos a 25°C, se añaden 70 nM de t-PA humano recombinante, y la combinación de este compuesto, PAI-1 y tPA se incuba durante 30 minutos adicionales. Después de la segunda incubación, se añade Spectrozyme tPA y la absorbancia se lee a 405 nm a 0 y 60 minutos. La actividad inhibidora relativa de PAI-1 es igual a la actividad residual de tPA en el tratamiento con Tiplaxtinin/PAI-1. Los tratamientos de control incluyen la inhibición completa de tPA por PAI-1 en la relación molar empleada (2:1), y la ausencia de cualquier efecto sobre t-PA solo. El ensayo inmunofuncional se basa en la interacción no disociable por SDS entre tPA y PAI-1 activo. Las placas de ensayo se recubren con 100 µl de una solución de t-PA (10 µg/ml en TBS) y se mantienen a 4 °C durante la noche. Este compuesto se disuelve en DMSO y se diluye a una concentración final de 1-100 µM como se describió anteriormente. Luego se incuba con PAI-1 humano (50 ng/ml) durante 15 minutos, y una alícuota de esta solución se añade a la placa recubierta con t-PA durante 1 h. La solución se aspira de la placa, que luego se lava con un tampón que consiste en 0,05% de Tween 20 y 0,1% de BSA en TBS. Este ensayo detecta solo el PAI-1 inhibidor activo (no latente o sustrato) unido a la placa, y se cuantifica utilizando un anticuerpo monoclonal contra PAI-1 humano (MA33B8). Una dilución 1000X de MA33B8 se añade a la placa y se incuba durante una hora, se aspira y se lava. Se añade un anticuerpo secundario consistente en un conjugado de fosfatasa alcalina IgG (H+L)-AP de cabra anti-ratón, se incuba durante una hora, se aspira y se lava. Se añade una alícuota de 100 µl de solución de fosfatasa alcalina, seguida de la determinación de la absorbancia a 405 nm 60 minutos después. La cuantificación del PAI-1 activo residual unido a t-PA a diferentes concentraciones se utiliza para determinar la IC50 ajustando los resultados a un programa logístico de dosis-respuesta, con la IC50 definida como la concentración del compuesto requerida para lograr el 50% de inhibición de la actividad de PAI-1. La sensibilidad del ensayo es de 5 ng/ml de PAI-1 humano, según lo determinado a partir de una curva estándar que va de 0 a 100 ng/ml de PAI-1 humano.

T24, UM-UC-14, UROtsa, and HeLa cells

~50 μM

24 h

Briefly, cell lines, T24, UM-UC-14, UROtsa, and HeLa cells are plated in 96-well dishes in triplicate at 1 ?10³ cells per well and allowed to adhere for 24 hours. Subsequently, tiplaxtinin (PAI-039) is added to the wells and allowed to incubate at the indicated concentrations. Cellular proliferation is determined by CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay according to manufacturer's instructions at 24 hours, and its IC50 is determined in Graphpad Prism. Luminescence was measured using a FLUOstar OPTIMA Reader.

Rat with carotid thrombosis

1 mg/kg

p.o.