Sunitinib (SU11248) Malate

Sunitinib también inhibe potentemente Kit y FLT-3. [1] Sunitinib es un potente inhibidor ATP-competitivo de VEGFR2 (Flk1) y PDGFRβ con K_i de 9 nM y 8 nM, respectivamente, mostrando una selectividad >10 veces mayor para VEGFR2 y PDGFR que para FGFR-1, EGFR, Cdk2, Met, IGFR-1, Abl y src. En células NIH-3T3 privadas de suero que expresan VEGFR2 o PDGFRβ, Sunitinib inhibe la fosforilación de VEGFR2 dependiente de VEGF y la fosforilación de PDGFRβ dependiente de PDGF con IC50 de 10 nM y 10 nM, respectivamente. Sunitinib inhibe la proliferación de HUVEC privadas de suero inducida por VEGF con IC50 de 40 nM, y inhibe la proliferación de células NIH-3T3 que sobreexpresan PDGFRβ o PDGFRα inducida por PDGF con IC50 de 39 nM y 69 nM, respectivamente. [2] Sunitinib inhibe la fosforilación de FLT3 de tipo salvaje, FLT3-ITD y FLT3-Asp835 con IC50 de 250 nM, 50 nM y 30 nM, respectivamente. Sunitinib inhibe la proliferación de células MV4;11 y OC1-AML5 con IC50 de 8 nM y 14 nM, respectivamente, e induce apoptosis de manera dosis-dependiente. [3]

De acuerdo con la inhibición sustancial y selectiva de la fosforilación y señalización de VEGFR2 o PDGFR in vivo, Sunitinib (20-80 mg/kg/día) exhibe una actividad antitumoral amplia y potente dependiente de la dosis contra una variedad de modelos de xenoinjertos tumorales que incluyen HT-29, A431, Colo205, H-460, SF763T, C6, A375 o MDA-MB-435. La dosificación con Sunitinib a 80 mg/kg/día durante 21 días conduce a una regresión tumoral completa en seis de ocho ratones, sin un nuevo crecimiento tumoral durante un período de observación de 110 días después del final del tratamiento. La segunda ronda de tratamiento con Sunitinib sigue siendo eficaz contra los tumores que no han retrocedido por completo durante la primera ronda de tratamiento. El tratamiento con Sunitinib da como resultado una disminución significativa en la MVD tumoral, con una reducción de aproximadamente el 40% en los tumores de glioma SF763T. El tratamiento con SU11248 da como resultado una inhibición completa del crecimiento tumoral adicional de xenoinjertos de PC-3M que expresan luciferasa, a pesar de que no hay reducción en el tamaño del tumor. [2] El tratamiento con Sunitinib (20 mg/kg/día) suprime drásticamente el crecimiento de xenoinjertos subcutáneos de MV4;11 (FLT3-ITD) y prolonga la supervivencia en el modelo de injerto de médula ósea FLT3-ITD. [3]

• Ensayos bioquímicos de Tirosina Quinasa

  Los valores de IC50 para Sunitinib contra VEGFR2 (Flk-1) y PDGFRβ se determinan utilizando proteínas de fusión de glutatión S-transferasa que contienen el dominio citoplasmático completo del RTK. Los ensayos bioquímicos de tirosina quinasa para cuantificar la actividad de transfosforilación de VEGFR2 (Flk-1) y PDGFRβ se realizan en microplacas de 96 pocillos pre-recubiertas (20 μg/pocillo en PBS; incubadas durante la noche a 4 °C) con el sustrato peptídico poli-Glu,Tyr (4:1). Los sitios de unión a proteínas en exceso se bloquean con la adición de 1-5% (p/v) de BSA en PBS. Las proteínas de fusión GST purificadas se producen en células de insecto infectadas con baculovirus. GST-VEGFR2 y GST-PDGFRβ se añaden luego a los pocillos de la microplaca en un tampón de dilución de quinasa a 2 × concentración que consiste en 100 mM HEPES, 50 mM NaCl, 40 μM NaVO₄ y 0,02% (p/v) de BSA. La concentración enzimática final para GST-VEGFR2 o GST-PDGFRβ es de 50 ng/mL. Posteriormente, se añaden veinticinco μL de Sunitinib diluido a cada pocillo de reacción para producir un rango de concentraciones de inhibidor apropiadas para cada enzima. La reacción de la quinasa se inicia mediante la adición de diferentes concentraciones de ATP en una solución de MnCl₂ de modo que las concentraciones finales de ATP abarquen el Km para la enzima, y la concentración final de MnCl₂ sea de 10 mM. Las placas se incuban durante 5-15 minutos a temperatura ambiente antes de detener la reacción con la adición de EDTA. Luego, las placas se lavan tres veces con TBST. Se añaden antisueros policlonales de conejo antifosfotirosina a los pocillos en una dilución de 1:10,000 en TBST que contiene 0,5% (p/v) de BSA, 0,025% (p/v) de leche desnatada en polvo y 100 μM de NaVO₄ y se incuban durante 1 hora a 37 °C. Luego, las placas se lavan tres veces con TBST, seguido de la adición de antisueros de cabra antirratón conjugados con peroxidasa de rábano (dilución 1:10,000 en TBST). Las placas se incuban durante 1 hora a 37 °C y luego se lavan tres veces con TBST. La cantidad de fosfotirosina en cada pocillo se cuantifica después de la adición de 2,2′-azino-di-[3-etilbenzotiazolina sulfonato] como sustrato.

• Líneas celulares

  RS4;11, MV4;11, and OC1-AML5

• Concentraciones

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Tiempo de incubación

  24 and 48 hours

• Método

  Cells are starved overnight in medium containing 0.1% FBS prior to addition of Sunitinib and FL (50 ng/mL; FLT3-WT cells only). Proliferation is measured after 48 hours of culture using the Alamar Blue assay or trypan blue cell viability assays. Apoptosis is measured 24 hours after Sunitinib addition by Western blotting to detect cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) or levels of caspase-3.

• Modelos animales

  Female nu/nu mice implanted s.c. with HT-29, A431, Colo205, H-460, SF763T, C6, A375, or MDA-MB-435, and male nu/nu mice bearing luciferase-expressing PC-3M tumors

• Dosificaciones

  ~80 mg/kg

• Administración

  Orally once daily