Sulforhodamine B sodium salt

Ensayo colorimétrico de Sulforhodamine B en cultivo celular para analizar la proliferación celular
1. Prepare soluciones de tratamiento con volumen suficiente para triplicados en placas de 96 pocillos (50 μl por réplica) o seis réplicas en placas de 384 pocillos (10 μl por réplica). Asegúrese de que los volúmenes tengan en cuenta las variaciones de pipeteo.
2. Las soluciones de tratamiento se pueden preparar en solución acuosa (por ejemplo, Opti-MEM para transfecciones) o en un disolvente adecuado (por ejemplo, DMSO).
3. Retire el medio de las monocapas celulares y lave las células una vez con PBS esterilizado. Agregue 1 ml (para placas de 100 mm) de tripsina al 0,25 % para cubrir uniformemente la superficie de crecimiento celular.
4. Incube a 37 °C durante 5 minutos o hasta que las células comiencen a disociarse. Inactive la tripsina con 10 volúmenes de medio de cultivo que contenga FBS. Mezcle de arriba a abajo para obtener una suspensión homogénea de células individuales.
5. Transfiera la suspensión celular a un tubo Falcon estéril.
6. Determine la concentración celular usando una cámara de hematocitómetro con una mezcla 1:1 de suspensión celular y solución de azul tripán al 0,4 %. Opcionalmente, centrifuge las células antes de contarlas para lavar la tripsina y resuspenderlas en un medio de crecimiento.
7. Ajuste la concentración celular con medio de crecimiento (10 % de FBS) para una densidad de siembra celular apropiada por pocillo.
8. Mezcle las soluciones de tratamiento y dispense 50 μl (formato de 96 pocillos) o 10 μl (formato de 384 pocillos) en cada pocillo.
9. Mezcle a fondo la suspensión celular y agregue 50 μl (formato de 96 pocillos) o 10 μl (formato de 384 pocillos) a cada pocillo con las soluciones de tratamiento.
Nota: Asegure una distribución celular uniforme en el fondo del pocillo, evitando agitar para prevenir 'efectos de anillo'.
10. Reserve tres pocillos para el control no tratado o con vehículo y tres pocillos para la resta de fondo e incube la placa a 37 °C con 5 % de CO2 hasta que esté lista para la lectura.
11. Agregue 25 μl (formato de 96 pocillos) o 5 μl (formato de 384 pocillos) de TCA frío al 50 % directamente al sobrenadante del medio. Incube las placas a 4 °C durante 1 hora sin mezclar.
12. Lave las placas cuatro veces sumergiéndolas en agua del grifo que corra lentamente y golpeando el exceso de agua en una toalla de papel. Deje secar la placa al aire a temperatura ambiente.
13. Agregue 50 μl (formato de 96 pocillos) o 20 μl (formato de 384 pocillos) de solución de SRB al 0,04 % a cada pocillo.
14. Incube a temperatura ambiente durante 1 hora y enjuague las placas cuatro veces con ácido acético al 1 % (200 μl para el formato de 96 pocillos o 30 μl para el formato de 384 pocillos). Deje secar la placa al aire a temperatura ambiente.
15. Agregue 50 μl a 100 μl de solución base Tris de 10 mM (pH 10,5) a cada pocillo y agite la placa en un agitador orbital durante 10 minutos para solubilizar el colorante unido a proteínas.
16. Mida la absorbancia a 510 nm en un lector de microplacas.