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Descripción biológica
| Especificidad | SSEA4 Antibody [E20H6] detecta niveles endógenos de proteína SSEA4 total. |
|---|---|
| Antecedentes | SSEA4 (Stage-Specific Embryonic Antigen 4) es un epítopo glicolipídico hexasacárido sialilado (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-Cer) que se encuentra en células madre embrionarias humanas (hESC), células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células de teratocarcinoma y células madre cancerosas, pero está ausente en células somáticas diferenciadas o células pluripotentes de ratón. Su grupo principal de carbohidratos adopta una conformación en forma de herradura reconocida por los anticuerpos MC813 a través de una red de enlaces de hidrógeno que involucran el carboxilato del ácido siálico terminal (Neu5Ac) con Asp54H/Gly53H y los hidroxilos de N-acetil GalNAc con Asp49L, lo que respalda su utilidad para la detección específica de estados de pluripotencia mediante citometría de flujo e inmunohistoquímica. El enlace α-Gal rígido del glicano y los enlaces glicosídicos β1-3 mantienen una conformación estable y extendida sobre las colas lipídicas de ceramida en las membranas plasmáticas, donde SSEA4 apoya activamente la pluripotencia modulando la señalización Wnt/β-catenina a través de la interacción directa con el co-receptor LRP6, lo que permite la activación de la vía independiente del ligando, y reclutando PI3K/Akt a través de la agrupación mediada por glicanos que mantiene la circuitería Nanog/Oct4/Sox2 esencial para la autorrenovación. Durante la diferenciación, la regulación a la baja de las glicosiltransferasas (ST3GAL6, B3GALT5) elimina progresivamente el ácido siálico terminal, convirtiendo SSEA4 en SSEA3 y extinguiendo su competencia de señalización. |
Información de uso
| Aplicación | IF, FCM | Dilución |
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|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Reactividad | Human | ||||||
| Fuente | Mouse Monoclonal Antibody | MW | |||||
| Tampón de almacenamiento | PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 | Almacenamiento (Desde la fecha de recepción) |
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years | ||||
| IF |
Experimental Protocol:
Sample Preparation
1. Adherent Cells: Place a clean, sterile coverslip in a culture dish. Once the cells grow to near confluence as a monolayer, remove the coverslip for further use.
2. Suspension Cells: Seed the cells onto a clean, sterile slide coated with poly-L-lysine.
3. Frozen Sections: Allow the slide to thaw at room temperature. Wash it with pure water or PBS for 2 times, 3 minutes each time.
4. Paraffin Sections: Deparaffinization and rehydration. Wash the slide with pure water or PBS for 3 times, 3 minutes each time. Then perform antigen retrieval.
Fixation
1. Fix the cell coverslips/spots or tissue sections at room temperature using a fixative such as 4% paraformaldehyde (4% PFA) for 10-15 minutes.
2. Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Permeabilization
1.Add a detergent such as 0.1–0.3% Triton X-100 to the sample and incubate at room temperature for 10–20 minutes.
(Note: This step is only required for intracellular antigens. For antigens expressed on the cell membrane, this step is unnecessary.)
Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Blocking
Add blocking solution and incubate at room temperature for at least 1 hour. (Common blocking solutions include: serum from the same source as the secondary antibody, BSA, or goat serum.)
Note: Ensure the sample remains moist during and after the blocking step to prevent drying, which can lead to high background.
Immunofluorescence Staining (Day 1)
1. Remove the blocking solution and add the diluted primary antibody.
2. Incubate the sample in a humidified chamber at 4°C overnight.
Immunofluorescence Staining (Day 2)
1. Remove the primary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
2. Add the diluted fluorescent secondary antibody and incubate in the dark at 4°C for 1–2 hours.
3. Remove the secondary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
4. Add diluted DAPI and incubate at room temperature in the dark for 5–10 minutes.
5. Wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
Mounting
1. Mount the sample with an anti-fade mounting medium.
2. Allow the slide to dry at room temperature overnight in the dark.
3. Store the slide in a slide storage box at 4°C, protected from light.
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Referencias
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