Selisistat (EX-527)

Selisistat (EX 527) exhibe un potente efecto inhibidor contra la actividad desacetilasa de SIRT1 de manera dependiente de la concentración con una IC50 de 38 nM, y muestra una actividad mucho menor contra SIRT2 y SIRT3 con valores de IC50 de 19,6 μM y 48,7 μM, respectivamente. No inhibe SIRT4-7 ni la actividad de HDAC de clase I/II a concentraciones de hasta 100 μM. Este compuesto solo (1 μM) no tiene un efecto detectable sobre la acetilación de la lisina 382 de p53 en células NCI-H460, pero aumenta significativamente la cantidad de p53 acetilada en células NCI-H460, células epiteliales mamarias humanas, células U-2 OS y MCF-7 sometidas a agentes genotóxicos como el peróxido de hidrógeno, lo que es más efectivo que lo causado por la Nicotinamida (5 mM). Sorprendentemente, no produce efectos detectables sobre la expresión génica controlada por p53, la supervivencia celular o la proliferación celular. [1] Provoca un aumento del 90 % en el número de células HCT116 después de 7 días en la condición de 0,1 % de suero pero no de 10 % de suero, lo que sugiere que SIRT1 es un regulador significativo de la proliferación celular durante las condiciones de privación de factores de crecimiento. [2] Además, anula los efectos del resveratrol en las respuestas a la glucosa y previene la regulación al alza inducida por el resveratrol de Glut2, glucocinasa, Pdx-1 y Tfam en las células INS-1E, debido al efecto opuesto de EX 527 y el resveratrol sobre la actividad desacetilasa de SIRT1. [3]

La administración de Selisistat (EX 527; ~10 μg) a ratas aumenta los niveles hipotalámicos de acetil-p53 al inhibir la actividad de SIRT1 hipotalámica. La coadministración de este compuesto con grelina atenúa marcadamente la acción orexigénica de la grelina al disminuir los niveles de pAMPK, aumentar los niveles de ACC y abolir la mayor expresión de los factores de transcripción FoxO1, pCREB y Bsx y los neuropéptidos NPY y AgRP en el núcleo arqueado hipotalámico. [4]

• Inhibición de la actividad desacetilasa de GST-SIRT1

  Las células 293T se transfectan transitoriamente con SIRT1 humano marcado con GST en el vector pDEST27 Gateway usando FuGENE-6. Después de 48 horas, las células se lisan con 50 mM Tris, pH 8,0, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA y 0,5 % de Nonidet P-40, suplementado con tabletas de cóctel de inhibidores de proteasa Complete Mini. La GST-SIRT1 se purifica de los lisados y se lava extensamente en el tampón anterior. El ensayo de desacetilación se realiza con aproximadamente 30 ng de GST-SIRT1 en presencia de Selisistat (EX 527) (48 pM a 100 μM). La desacetilación se mide usando el kit Fluor de Lys empleando un péptido fluorogénico que abarca los residuos 379 a 382 de p53, acetilado en la lisina 382. El residuo de lisina acetilado se acopla a una porción de aminometilcumarina. El péptido es desacetilado por SIRT1, seguido de la adición de un revelador proteolítico que libera la aminometilcumarina fluorescente. Brevemente, las preparaciones enzimáticas se incuban con 170 μM de NAD⁺ y 100 μM de péptido fluorogénico p53 durante 45 minutos a 37 °C, seguido de incubación en el revelador durante 15 minutos a 37 °C. La fluorescencia se mide por excitación a 360 nm y emisión a 460 nm y la actividad enzimática se expresa en unidades de fluorescencia relativa.

• Líneas celulares

  NCI-H460, MCF-7, U-2 OS and HMEC

• Concentraciones

  Dissolved in DMSO, final concentration 1 μM

• Tiempo de incubación

  48 or 72 hours

• Método

  For viability assays, cells are treated with Selisistat (EX 527) for 48 hours. Cell viability is then determined using the Cell Titer-Glo luminescent assay, which measures total ATP level as an index of cell number. Luminescence is measured on a Luminoskan Ascent. For the proliferation assay, 0.5 μCi/mL of [¹⁴C]thymidine is added to the medium immediately after this compound. Plates are counted at 48 hours (HMEC) or 72 hours (NCI-H460, MCF-7, and U-2 OS cells) in a Microbeta liquid scintillation counter. Thymidine incorporated by the cells is detected by proximity to the scintillant in the base of the Cytostar-T tissue culture plate.

• Modelos animales

  Male Sprague-Dawley rats

• Dosificaciones

  ~5 μg/rat

• Administración

  Intracerebroventricular injection