Salirasib

Se utilizan membranas sinaptosomales de cerebelo de cerebro de rata o membranas totales de líneas celulares cultivadas (pellet de 100.000 × g) para ensayos de metiltransferasa en sistemas libres de células. Los ensayos de metiltransferasa se realizan a 37 °C en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, utilizando 100 μg de proteína, 25 μM de [metil-³H]AdoMet (300.000 cpm/nmol) y 50 μM de AFC (preparado como una solución madre en DMSO) en un volumen total de 50 μL. La concentración de DMSO en todos los ensayos es del 8 %. Se utilizan varias concentraciones de este compuesto en varios experimentos según se indica en el texto. Las reacciones se terminan después de 10 min mediante la adición de 500 μL de cloroformo:metanol (1:1) con la subsiguiente adición de 250 μL de H₂O, mezcla y separación de fases. Una porción de 125 μL de la fase de cloroformo se seca a 40 °C, y se añaden 200 μL de solución de NaOH 1 N, 1 % SDS. El metanol así formado se cuenta mediante el método de equilibrio de fase de vapor. Los recuentos de fondo típicos (sin AFC añadido) son de 50-100 cpm, mientras que las reacciones típicas con este químico producen de 500 a 6.000 cpm. Los ensayos se realizan por triplicado y se restan los recuentos de fondo. Se realiza la metilación de sustratos endógenos y la electroforesis en gel. La metilación del carboxilo de proteínas en células intactas se determina utilizando 100 μCi/mL de [metil-³H]metionina. Las células se ensayan en cultivos casi confluentes cultivados en placas de 10 cm con 5 mL de medio de marcaje.

PC12, CHE, T-antigen-transformed CHE, endothelial cells, astrocytes, B16, Rat1, EJ, NIH3T3, v-Raf-transformed NIH3T3 cell lines

~100 μM

10 days

Cells are grown in 24-well plates. 2 h after plating, the cells receive either solvent or this compound freshly prepared from a stock solution to yield the final indicated concentrations in 0.1% DMSO. Media are replaced every 4 days with fresh medium containing the solvent or the drug. Separate experiments indicate that the solvent itself has no effect on cell growth. On the indicated days, the cells are detached from plates by trypsin/EDTA and counted under the light microscope. All assays are performed in quadruplicate. In parallel experiments, cells are stained either with trypan blue or with MTT, and the stained cells are examined under the light microscope. In some MTT-stained cultures, the cells are dissolved in 0.2 mL of 100% DMSO, and the extent of staining is determined spectrophotometrically using an enzyme-linked immunosorbent assay reader.

Panc-1 xenografted nude mice

5 mg/kg daily

i.p.