Ro-3306

RO-3306 inhibe la actividad de CDK1/ciclina B1, CDK1/ciclina A, CDK2/ciclina E y CDK4/ciclina D con un Ki de 35 nM, 110 nM, 340 nM y más de 2000 nM, respectivamente. El tratamiento de células HCT116, SW480 y HeLa con RO-3306 durante 20 h conduce a un bloqueo completo del ciclo celular en la fase G2/M. La proliferación de HCT116 y SW480 es bloqueada eficazmente por RO-3306. RO-3306 parece ser más proapoptótico en células cancerosas (HCT116 y SW480) que en células no tumorigenicas (MCF 10A y MCF 12A).[1]

RO-3306 detiene eficazmente la maduración de los ovocitos a una concentración de 10 μM.[2]

RO-3306 es un inhibidor CDK1 ATP-competitivo y selectivo.

• Ensayo de CDK

  La actividad de CDK1 ciclina B1, CDK1 ciclina A, CDK2 ciclina E y CDK4 ciclina D se mide mediante un ensayo de fluorescencia resuelta en el tiempo homogénea en formato de 96 pocillos. El tampón de ensayo contenía 25 mM Hepes, 6,25 mM MgCl2, 0,003% Tween 20, 0,3 mg/mL BSA, 1,5 mM DTT y ATP de la siguiente manera: 162 μM (CDK1), 90 mM (CDK2) o 135 μM (CDK4). El tampón de CDK1 y CDK2 contenía 10 mM MgCl2. Los compuestos de prueba se diluyen en tampón de ensayo a 3 veces su concentración final en 20 μL, y la reacción se inicia añadiendo 40 μL de tampón de ensayo que contiene el sustrato pRB (0,185 μM). Las placas se incuban a 37°C durante 30 min con agitación constante, y la reacción se termina añadiendo 15 μL de anticuerpo anti-pRB fosforilado (Ser-780) a 1,6 μM en 25 mM Hepes, 24 mM EDTA y 0,2 mg/mL BSA. Tras una incubación adicional de 30 min con agitación, se añaden 15 μL de 3 nM de IgG anti-conejo marcada con Lance-Eu-W1024 y 60 nM de anticuerpo anti-His-6 conjugado con aloficocianina en 25 mM Hepes y 0,5 mg/mL BSA, y se incuba durante 1 h. Las placas se leen en el lector multi-etiquetas Victor-V con excitación a 340 nm y emisión a 615 nm y 665 nm. Los valores de IC50 se calculan a partir de las lecturas a 665 nm y se normalizan para las lecturas de Europio a 615 nm. Los valores de Ki se calculan según la ecuación: Ki = IC50/(1 + S/Km ), donde S es la concentración de ATP en el ensayo y Km es la constante de Michaelis-Menten para el ATP. La actividad inhibidora contra el panel de quinasas se determina mediante la tecnología de ensayo IMAP.

• Líneas celulares

  MDA-MB-231 cell line

• Concentraciones

  20 μM

• Tiempo de incubación

  72 h

• Método

  Log phases cells (25,000) are seeed in 96-well plates and incubated in a 37℃ incubator with CO2, After 24 h, different concentrations of RO-3306 are administered to determine the drug concentrations required to achieve a 50% growth inhibition (IC50). MTT (20 μL, 5mg/mL stock solution in saline) is added to each well and the cells are incubated for 4 h. Supernatants are removed and formazan crystals from viable cells are solubilized with 200 μL anhydrous DMSO. The absorbance is detected with a 550 model microplate reader at the 565 nm wavelength.

• Modelos animales

  Female BALB/c mice

• Dosificaciones

  1.5 mg/kg

• Administración

  i.n.