Rapamycin (Sirolimus)

La Rapamycin inhibe la actividad endógena de mTOR en células HEK293 con una IC50 de ~0.1 nM, más potentemente que iRap y AP21967 con IC50 de ~5 nM y ~10 nM, respectivamente. [1] En Saccharomyces cerevisiae, el tratamiento con este compuesto induce una severa detención del ciclo celular G1/S e inhibición del inicio de la traducción a niveles por debajo del 20% del control. [2] Inhibe significativamente la viabilidad celular de T98G y U87-MG de una manera dosis-dependiente con IC50 de 2 nM y 1 μM, respectivamente, mientras que muestra poca actividad contra las células U373-MG con IC50 de >25 μM a pesar de la extensión similar de la inhibición de la señalización de mTOR. Este químico (100 nM) induce la detención en G1 y Autophagy pero no la apoptosis en células U87-MG y T98G sensibles a la Rapamycin al inhibir la función de mTOR. [3]

El tratamiento con Rapamycin in vivo bloquea específicamente dianas conocidas por estar aguas abajo de mTOR, como la fosforilación y activación de p70S6K y la liberación de la inhibición de eIF4E por PHAS-1/4E-BP1, lo que conduce al bloqueo completo de los aumentos hipertróficos en el peso del músculo plantar y el tamaño de las fibras. [4] El tratamiento a corto plazo con este compuesto, incluso a la dosis más baja de 0.16 mg/kg, produce una profunda inhibición de la actividad de p70S6K, lo que se correlaciona con un aumento de la muerte de células tumorales y la necrosis de los tumores renales de Eker. [5] Este químico inhibe el crecimiento tumoral metastásico y la angiogénesis en modelos de xenoinjerto CT-26 al reducir la producción de VEGF y el bloqueo de la señalización de células endoteliales inducida por VEGF. [6] El tratamiento con este compuesto a 4 mg/kg/día reduce significativamente el crecimiento tumoral de los xenoinjertos C6 y la permeabilidad vascular tumoral. [7]

• Inmunoblot para el ensayo de quinasa mTOR

  Las células HEK293 se siembran a 2-2.5×10⁵ células/pozo de una placa de 12 pocillos y se privan de suero durante 24 horas en DMEM. Las células se tratan con concentraciones crecientes de Rapamycin (0.05-50 nM) durante 15 minutos a 37 °C. Se añade suero a una concentración final del 20% durante 30 minutos a 37 °C. Las células se lisan y los lisados celulares se separan por SDS-PAGE. Las proteínas resueltas se transfieren a una membrana de difluoruro de polivinilideno y se someten a inmunotransferencia con un anticuerpo primario fosfoespecífico contra Thr-389 de la p70 S6 quinasa. Los datos se analizan utilizando ImageQuant y KaleidaGr

• Líneas celulares

  U87-MG, T98G, and U373-MG

• Concentraciones

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~25 μM

• Tiempo de incubación

  72 hours

• Método

  Cells are exposed to various concentrations of Rapamycin for 72 hours. For the assessment of cell viability, cells are collected by trypsinization, stained with trypan blue, and the viable cells in each well are counted. For the determination of cell cycle, cells are trypsinized, fixed with 70% ethanol, and stained with propidium iodide using a flow cytometry reagent set. Samples are analyzed for DNA content using a FACScan flow cytometer and CellQuest software. For apoptosis detection, cells are stained with the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique using an ApopTag apoptosis detection kit. To detect the development of acidic vesicular organelles (AVO), cells are stained with acridine orange (1 μg/mL) for 15 minutes, and examined under a fluorescence microscope. To quantify the development of AVOs, cells are stained with acridine orange (1 μg/mL) for 15 minutes, removed from the plate with trypsin-EDTA, and analyzed using the FACScan flow cytometer and CellQuest software. To analyze the autophagic process, cells are incubated for 10 minutes with 0.05 mM monodansylcadaverine at 37 °C and are then observed under a fluorescence microscope.

• Modelos animales

  Athymic Nu/Nu mice inoculated subcutaneously with VEGF-A-expressing C6 rat glioma cells

• Dosificaciones

  ~4 mg/kg/day

• Administración

  Injection i.p.