RAF709

RAF709 parece tener una cinética de disociación muy lenta (T_1/2 > 6,5 h) utilizando el método de dilución rápida para medir su constante de velocidad de disociación. En los ensayos celulares, la respuesta dosis-efecto de pMEK y pERK se mide en células Calu-6 con EC50 de 0,02 y 0,1 M con una activación paradójica mínima y una inhibición de la proliferación con EC50 de 0,95 M. Este compuesto estabiliza los dímeros BRAF-CRAF con un EC50 de 0,8 M. De las 456 quinasas probadas, este químico muestra un alto nivel de selectividad, demostrando una unión a diana superior al 99% a BRAF, BRAFV600E y CRAF a 1 M y muy pocos objetivos fuera de diana con DDR1 (>99%), DDR2 (86%), FRK (92%) y PDGFRb (96%), las únicas quinasas con una unión >80% a 1 M[1]. Muestra igual actividad contra monómeros y dímeros de RAF. En ensayos bioquímicos in vitro, este compuesto exhibe una potente actividad inhibidora dirigida a BRAF, BRAFV600E y CRAF con valores de IC50 que oscilan entre 0,3 y 1,5 nmol/L. Este tratamiento químico conduce a una inducción dosis-dependiente de la heterodimerización de B/CRAF en HCT116, pero inhibe la fosforilación de MEK y ERK, en línea con la capacidad de este compuesto para inhibir eficazmente los dímeros RAF. Inhibe selectivamente la señalización oncogénica y la proliferación en células tumorales con mutaciones BRAF, NRAS o KRAS con una activación paradójica mínima[2].

RAF709 es bien tolerado y eficaz en modelos de xenoinjerto mutante de KRAS. Es razonablemente estable en plasma después de una incubación de 3 h a 37 en todas las especies [estabilidad en plasma (% restante): rata 85%, ratón 82%, perro 95%, humano 101%], y la unión a proteínas plasmáticas se mide en un 98% en todas las especies. En experimentos farmacocinéticos, este compuesto tiene una depuración moderada en ratones (35 mL/min/kg) y perros (14 mL/min/kg) y una depuración alta en ratas (50 mL/min/kg). La Cmax en ratones (1 M), perros (0,5 M) y ratas (0,5 M) alcanzan concentraciones farmacológicamente activas, y se observa una biodisponibilidad oral aceptable en ratones (68%), ratas (24%) y perros (48%). En el modelo de ratón desnudo de xenoinjerto Calu-6, el tratamiento con este químico da como resultado una actividad antitumoral dependiente de la dosis, siendo 10 mg/kg subeficaz (%T/C = 92%), 30 mg/kg resultó en una actividad antitumoral medible (% T/C = 46%), y 200 mg/kg resultó en una regresión tumoral media del 92%, mientras que la misma dosis alta no es eficaz en el modelo PC3, KRAS WT[1].

• Ensayo de quinasa CRAF

  El ensayo de quinasa CRAF se llevó a cabo utilizando 10 nM de sustrato proteico MEK1 con quinasa inactiva (que porta una mutación K97R), 3 M de ATP y 10 pM de CRAF Y340E/Y341E. El tampón de reacción contenía 50 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 0,05% de BSA, 50 mM de NaCl, 0,01% de Tween-20 y 1 mM de DTT. Las reacciones se realizaron a temperatura ambiente en un volumen de 10 L en placas blancas de 384 pocillos de fondo plano durante 40 min y se detuvieron añadiendo 5 L/pocillo de solución de enfriamiento (50 mM Tris pH 7,5, 50 mM EDTA). Las reacciones terminadas recibieron 5 L/pocillo de reactivos de detección que consistían en 50 mM Tris pH 7,5, 0,01% de Tween-20, anticuerpo antifosfo MEK1/2 S217/S221 diluido 1:1000, 0,01 mg/mL de perlas aceptoras recubiertas de proteína A AlphaScreen y perlas donantes recubiertas de estreptavidina. Las placas se leyeron en un lector de placas EnVision después de una incubación nocturna a temperatura ambiente. En los estudios de inhibición de compuestos, este compuesto se probó en un rango de concentración de 25 M a 1,74 × 10⁻⁶ M en un formato de 16 puntos, 3 veces. El DMSO estaba a una concentración final del 0,5%. Este químico se preincubó con CRAF durante 30 min antes de añadir los sustratos para iniciar la reacción. Los datos de inhibición se ajustaron a una ecuación logística de cuatro parámetros para calcular la IC50 de los compuestos.

• Líneas celulares

  HCT116 cells

• Concentraciones

  0.1, 1, 10 μM

• Tiempo de incubación

  1 hour

• Método

  BRAF/CRAF dimerization is assessed by immunoprecipitating BRAF or CRAF, followed by Western blot analysis of BRAF and CRAF. Levels of pMEK and pERK in whole-cell lysates (WCL) are determined by Western blot analysis. GAPDH level is included as a loading control.

• Modelos animales

  Calu-6 model (tumor bearing mice)

• Dosificaciones

  10, 30, or 200 mg/kg

• Administración

  oral administration