PR-619

PR-619 es un inhibidor de DUB de amplio espectro de la clase piridinamina, permeable a las células, cuyos objetivos conocidos incluyen ATXN3, BAP1, JOSD2, OTUD5, UCH-L1, UCH-L3, UCH-L5/UCH37, USP1, 2, 4, 5, 7, 8, 9X, 10, 14, 15, 16, 19, 20, 22, 24, 28, 47, 48, VCIP135, YOD1, así como la deISGylase PLpro, la deNEDDylase DEN1 y la deSUMOlyase SENP6. Se ha demostrado que este compuesto aumenta la poliubiquitinación proteica global en células HEK293T de manera dependiente de la dosis y el tiempo (20 a 150 μM, 0,5 a 20 h). El tratamiento con este químico resulta en la regulación al alza de las cadenas de poliUb unidas a K⁴⁸ y a K⁶³. Induce la muerte celular HCT116 con valores de EC50 de 6,3 μM.[1]

PR-619 mejora el efecto antitumoral sobre el xenoinjerto de UC en ratones nude.

• Ensayo Ub-PLA₂

  Las enzimas recombinantes en 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM CaCl₂ y 2 mM β-mercaptoetanol (solución tampón del ensayo DUB) se preincuban con dosis únicas o rangos de dosis de PR-619 o P22077 durante 30 minutos en una placa de 96 pocillos antes de la adición de Ub-PLA₂ y NBD C6-HPC. La liberación de un producto fluorescente dentro del rango lineal del ensayo se monitoriza a temperatura ambiente utilizando un lector de placas de fluorescencia. Se incluyen como controles el vehículo (2%(v/v) DMSO) y 10 mM de N-etilmaleimida. Cuando se observa una inhibición ≥60%, los valores de EC50 se determinan utilizando una ecuación de respuesta a la dosis sigmoidea.

• Líneas celulares

  HCT116, HEK293T

• Concentraciones

  0.5-50 μM

• Tiempo de incubación

  72 h

• Método

  72 h hours later, 0.2 mg/mL resazurin prepared in phosphate-buffered saline is added to each well and the cells are incubated for an additional 3-6 h. The fluorescence of the resazurin reduction product is measured using Ex=535 nm and Em=590 nm filters on a fluorimeter. The EC50 values are calculated in Prism.