PP2 (AGL 1879)

PP2 inhibe Src uniéndose a un área de la molécula que no se superpone con el dominio de unión a ATP. [2] Este compuesto (20 μM) induce una inhibición del crecimiento del 40-50% de las células HT29, esta concentración reduce la actividad de Src tan pronto como 1 hora y mantiene una inhibición del 35% de la actividad de Src durante 2 días. Él (100 mM) disminuye la actividad de Src de las células HT29 de manera dosis-dependiente. Este químico (1 mM-100 mM) causa una inhibición del crecimiento dosis-dependiente de células de cáncer de colon humano (HT29, SW480 y PMCO1), células de cáncer de hígado (PLC/PRF/5, KYN-2, Li7 y HepG2) y células de cáncer de mama (MCF-7, MDA-MB-468 y BT-474). Él (20 μM) aumenta significativamente la agregación en la mayoría de las células cancerosas (HT29, SW480, PMCO1, PLC/PRF/5, KYN-2, Li7, MCF-7 y MDA-MB-468) de manera dependiente de E-cadherina. Este compuesto (20 μM) mejora la expresión de E-cadherina y también aumenta fuertemente la asociación de E-cadherina con el citoesqueleto de actina en las células cancerosas. Él (20 μM) aumenta la expresión de α-catenina, β-catenina y γ-catenina en las células HT29, mientras que en las células PLC/PRF/5 y MCF-7, el nivel total de proteína de α-catenina no cambia, pero los niveles de β-catenina y γ-catenina aumentan ligeramente. [3] Este inhibidor inhibe la proliferación de dos células de cáncer cervical (HeLa y SiHa) de manera dependiente del tiempo y la dosis. Él (10 μM) regula a la baja los niveles de expresión de pSrc-Y416, pEGFR-Y845 y -Y1173 en las células HeLa y SiHa. Este químico (10 μM) podría modular la detención del ciclo celular al regular al alza p21(Cip1) y p27(Kip1) en ambas células HeLa y SiHa y al regular a la baja la expresión de ciclina A y quinasa dependiente de ciclina-2, -4 (Cdk-2, -4) en HeLa y de ciclina B y Cdk-2 en SiHa. [4]

PP2 (5 mg/kg/día) induce cierta ralentización en la tasa de crecimiento de los tumores primarios en relación con el control tratado con vehículo en ratones SCID inoculados con células HT29 en el bazo. Este compuesto induce cierta ralentización en la tasa de crecimiento de los tumores primarios en relación con el control tratado con vehículo en ratones SCID inoculados con células HT29 en el bazo. Este químico reduce significativamente el peso relativo del hígado y el volumen de metástasis hepáticas en comparación con los controles en ratones SCID inoculados con células HT29 en el bazo. [3] Ratas tratadas con este compuesto (1,5 mg/kg i.p.) muestran una reducción aproximada del 50% del tamaño del infarto en la resonancia magnética ponderada en T2 y en la tinción con TTC en comparación con los controles en ratas con lesión cerebral isquémica focal. Este químico resulta en una mejor puntuación neurológica que los controles en ratas con lesión cerebral isquémica focal. [5]

• Ensayos enzimáticos de complejo inmune

  La enolasa tratada con ácido se diluye 1:20 con 1× PBS antes de alícuotar 100 μL/pocillo en una placa de ensayo Nunc de 96 pocillos de alta unión a proteínas. Los pocillos de ensayo se aspiran; se bloquean con 0,5% de suero bovino, 1× PBS durante 1 h a 37 ℃; y luego se lavan cinco veces con 300 μL de 1× PBS/pocillo. La fuente de Lck es bien células LSTRA o Lck expresada en células HeLa utilizando un sistema de expresión de vaccinia. FynT se expresa en células HeLa utilizando el sistema de vaccinia. Las células (12,5×10⁶/mL) se lisan en tampón de lisis, y los lisados se clarifican por centrifugación a 14.000 cpm durante 15 min a 4 ℃ en un tubo Eppendorf. Los lisados clarificados se incuban luego con el anticuerpo anti-quinasa apropiado a 10 μg/mL durante 2 h a 4 ℃. Se añaden perlas de Proteína A-Sepharose a la mezcla de anticuerpo/lisado a 250 μL/mL y se dejan incubar durante 30 min a 4 ℃. Las perlas se lavan luego dos veces en 1 mL de tampón de lisis y dos veces en 1 mL de tampón de quinasa (25 mM HEPES, 3 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂ y 100 μM ortovanadato de sodio) y se resuspenden al 50% (p/v) en tampón de quinasa. Se añaden veinticinco microlitros de la suspensión de perlas a cada pocillo de la placa de 96 pocillos de alta unión a proteínas recubierta con enolasa junto con una concentración apropiada de este compuesto y [γ-³²P]ATP (25 μL/pocillo de una solución de 200 μCi/mL en tampón de quinasa). Después de una incubación de 20 min a 20 ℃, se añaden 60 μL de tampón de solubilización 2× hirviendo que contiene 10 mM ATP a los pocillos de ensayo para terminar las reacciones. Treinta microlitros de las muestras se retiran de los pocillos, se hierven durante 5 min y se corren en un gel de SDS-poliacrilamida al 7,5%. Los geles se secan posteriormente y se exponen a una película Kodak X-AR. Para la cuantificación, las películas se escanean usando un escáner láser Molecular Dynamics, y se determina la densidad óptica de la banda de sustrato principal, enolasa p46. En experimentos complementarios para medir la actividad de este químico contra Lck, la placa de ensayo se lava con dos ciclos de lavado en un recolector Skatron usando 50 mM EDTA, 1 mM ATP. Se añade luego líquido de centelleo (100 μL) a los pocillos, y la incorporación de ³²P se mide usando un micro-β-contador.

• Líneas celulares

  HT29, SW480, PMCO1, PLC/PRF/5, KYN-2, Li7, HepG2, MCF-7, MDA-MB-468 and BT-474 cell lines

• Concentraciones

  ~100 μM

• Tiempo de incubación

  2 days

• Método

  Cell viability is determined using an in vitro toxicology assay kit following the manufacturer’s instructions. Cells are seeded in 96-well plates at day 0. Starting at day 1, cells are treated for 2 days with each of a series of increasing concentrations of PP2 (1 μM, 10 μM, and 100 μM). At the end of this period, cell proliferation is evaluated  by mitochondria dehydrogenase in viable cells, leading to formazan formation. This experiment is repeated three times with 10 determinations/tested concentration.

• Modelos animales

  SCID mice inoculated HT29 cells in the spleen

• Dosificaciones

  5 mg/kg/day

• Administración

  intraperitoneal injection