PHA-767491 HCl

PHA-767491 muestra aproximadamente 20 veces la selectividad para Cdk1, Cdk2 y GSK3-β, 50 veces la selectividad para MK2 y Cdk5 y 100 veces la selectividad para PLK1 y CHK2. PHA-767491 inhibe la proliferación celular en una variedad de líneas celulares humanas con una IC50 de 0,86 μM para SF-268 a 5,87 μM para K562, e induce significativamente la apoptosis de manera p53-independiente en casi todas las líneas celulares, en contraste con el 5-FU, que solo funciona en unas pocas líneas celulares. A diferencia de los inhibidores actuales de la síntesis de ADN, el tratamiento con PHA-767491 a 5 μM bloquea la iniciación de la replicación del ADN, pero no la progresión de la horquilla de replicación, debido a la inhibición específica de la cinasa Cdc7 y la fosforilación de Mcm2 en el sitio Ser40 dependiente de Cdc7. [1] Los niveles elevados de Mcl-1 en células OCI-LY1 y SU-DHL-4 resistentes a ABT-737 pueden disminuirse significativamente mediante el tratamiento con PHA-767491 a 3 μM, posiblemente debido a la inhibición de Cdk9, lo que lleva a la restauración de la sensibilidad a ABT-737. [2] El efecto pro-apoptótico directo dependiente de mitocondrias de PHA-767491 también se observa cuando se aplica a 1 μM en células quiescentes de leucemia linfocítica crónica (CLL) a través del mismo mecanismo con una EC50 de 0,34-0,97 μM. Mientras que en células CLL proliferativas estimuladas por CD154 e interleucina-4, el tratamiento con PHA-767491 a 5 μM anula la síntesis de ADN al inhibir Cdc7 en lugar de desencadenar la muerte celular. [3]

La administración de PHA-767491 dos veces al día durante 5 días inhibe significativamente el crecimiento del xenoinjerto HL60 de manera dosis-dependiente con un TGI del 50 % y 92 % a dosis de 20 mg/kg y 30 mg/kg, respectivamente, cuyo efecto también se observa en los modelos de xenoinjerto A2780, Mx-1 y HCT-116, así como en los carcinomas mamarios, y se correlaciona con la inhibición de Cdc7 y la posterior disminución de la fosforilación de Mcm2 en el sitio Ser40 dependiente de Cdc7 [1]

• Ensayos de cinasa in vitro

  La inhibición de Cdc7 y CDK9 por PHA-767491 (IC50) se determina utilizando el ensayo basado en el intercambiador aniónico fuerte (resina Dowex 1-X8, forma formato). Para cada enzima, se determinan inicialmente los valores K_m absolutos para ATP y el sustrato específico, y luego cada ensayo se realiza a concentraciones optimizadas de mezcla de ATP/³³P-γ-ATP (2K_m) y sustrato (5K_m). El ensayo de la cinasa Cdc7 se realiza en un tampón que contiene 50 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl₂, 2 mM β-glicerofosfato, 0,2 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, mezcla de ATP/³³P-γ-ATP 2K_m, Mcm2 5K_m (aa 10-294), 37 nM de Cdc7/Dbf4 recombinante y una concentración creciente de PHA-767491 en un volumen final de 30 μL, y se incuba durante 1 hora a 25 °C. El ensayo de la cinasa CDK9 se realiza utilizando 50 nM de Cdk9/ciclina T recombinante en 50 mM HEPES pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, mezcla de ATP/³³P-γ-ATP 2K_m, péptido CDT de ARN polimerasa 5K_m y una concentración creciente de PHA-767491 en un volumen final de 30 μL, y se incuba durante 1 hora a 25 °C. Después de la incubación, se añaden 150 μL de resina/formiato (pH 3,0) para detener la reacción y capturar el ³³P-γ-ATP sin reaccionar, separándolo del sustrato fosforilado en solución. Después de 1 hora de reposo, un volumen de 50 μL de sobrenadante se transfiere a placas de 96 pocillos Optiplate. Después de la adición de 150 μL de Microscint 40, la radioactividad se cuenta en el TopCount.

• Líneas celulares

  HeLa, MCF7, HCT-116, U2OS, A2780, K562, SF-539, SF-268, Ovcar8, SW480, COLO205, HCT-15, Jurkat, PC3, and NHDF

• Concentraciones

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~ 20 μM

• Tiempo de incubación

  24 or 72 hours

• Método

  Cells are exposed to PHA-767491 for 24 or 72 hours. Cells are lysed and the ATP content in the well, used as a measure of viable cells, is determined using a thermostable firefly luciferase–based assay. Activation of caspase-3 and caspase-7 is measured as a ratio between treated sample and untreated control with a luciferase-based assay, containing a specific proluminescent substrate. DNA replication is measured as incorporation of nucleotide analog BrdU into DNA by flow cytometry.

• Modelos animales

  Female SCID mice subcutaneously implanted with HL60 cells, male Hsd, athymic nu-nu mice subcutaneously implanted with HCT116 cells, A2780 or Mx-1 cells, and female Sprague-Dawley rats with mammary carcinomas

• Dosificaciones

  ~50 mg/kg

• Administración

  Intravenous or oral administration twice a day