Dacomitinib

PF299804 es un inhibidor específico de la familia de quinasas ERBB. Este compuesto inhibe la señalización del EGFR e induce la apoptosis en la línea celular H3255 GR que contiene EGFR T790M. Es eficaz en líneas celulares de NSCLC sensibles y no sensibles. Este producto químico inhibe el crecimiento de células H3255 y HCC827 diseñadas para expresar EGFR T790M. Inhibe la fosforilación de EGFR en presencia de la mutación T790M. [1] Se cree que este agente inhibe irreversiblemente la actividad de la tirosina quinasa ERBB mediante la unión al sitio de ATP y la modificación covalente de los residuos de cisteína nucleofílicos en los dominios catalíticos de los miembros de la familia ERBB. [2] Muestra efectos significativos de inhibición del crecimiento en células de cáncer gástrico amplificadas para HER2 (SNU216, N87), y tiene valores de concentración inhibitoria del 50 % más bajos en comparación con otros inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR, incluidos BIBW-2992 y CI-1033. Este inhibidor induce la apoptosis y la detención en G1 e inhibe la fosforilación de los receptores de la familia HER y las vías de señalización descendentes, incluidas STAT3, AKT y las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK) en células de cáncer gástrico amplificadas para HER2. También bloquea la formación de heterodímeros EGFR/HER2, HER2/HER3 y HER3/HER4, así como la asociación de HER3 con p85 α en células SNU216. [3] Una investigación reciente utiliza cuarenta y siete líneas celulares de cáncer de mama humano y epiteliales mamarias inmortalizadas para evaluar los efectos de inhibición de este compuesto; los resultados indican que inhibe preferentemente el crecimiento de líneas celulares de cáncer de mama amplificadas para HER-2 en comparación con las líneas no amplificadas (RR = 3,39, p < 0,0001). Este producto químico reduce la fosforilación de HER2, EGFR, HER4, AKT y ERK en la mayoría de las líneas sensibles. Ejerce su efecto antiproliferativo a través de una detención combinada en G0/G1 y una inducción de apoptosis. [4]

El PF299804 administrado por vía oral inhibe eficazmente el crecimiento de los xenoinjertos HCC827 Del/T790M. [1] Una baja administración oral de este compuesto (15 mg/kg) provoca una actividad antitumoral significativa, incluyendo regresiones tumorales marcadas en una variedad de modelos de xenoinjertos tumorales humanos que expresan y/o sobreexpresan miembros de la familia ERBB o que contienen la doble mutación (L858R/T790M) en ERBB1 (EGFR). [2]

• Ensayo de quinasa ERBB basado en ELISA

  Las proteínas de fusión citoplasmáticas ERBB1, ERBB2 y ERBB4 se obtienen clonando la secuencia ERBB1 (Met-668 a Ala-1211), ERBB2 (Ile-675 a Val-1256) y ERBB4 (Gly-259 a Gly-690) en el vector baculoviral pFastBac mediante PCR. Las proteínas se expresan en células de insecto Sf9 infectadas con baculovirus como proteínas de fusión GST. Las proteínas se purifican por cromatografía de afinidad utilizando perlas de sefarosa de glutatión. La inhibición de la actividad de la tirosina quinasa ERBB se evalúa utilizando un ensayo de tirosina quinasa de receptor basado en ELISA. Las reacciones de quinasa (50 mM HEPES, pH 7,4, 125 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 100 μM ortovanadato de sodio, 2 mM ditiotreitol, 20 μM ATP, este compuesto o control de vehículo, y 1-5 nM GST-erbB por 50 μL de mezcla de reacción) se realizan en placas de 96 pocillos recubiertas con 0,25 mg/mL de poli-Glu-Tyr. Las reacciones se incuban durante 6 minutos a temperatura ambiente mientras se agitan. Las reacciones de quinasa se detienen retirando la mezcla de reacción, y luego los pocillos se lavan con tampón de lavado (0,1 % Tween 20 en PBS). Los residuos de tirosina fosforilados se detectan añadiendo 0,2 μg/mL de anticuerpo antifosfotirosina (Oncogene Ab-4; 50 μL/pocillo) acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP) diluido en PBS que contiene 3 % de BSA y 0,05 % de Tween 20 durante 25 minutos mientras se agita a temperatura ambiente. El anticuerpo se retira y las placas se lavan en tampón de lavado. Se añade el sustrato HRP (SureBlue3,3 ,5,5-tetrametilbencidina o TMB) (50 μL por pocillo) y se incuba durante 10-20 minutos mientras se agita a temperatura ambiente. La reacción de TMB se detiene con la adición de 50 μL de solución de parada (0,09 N H₂SO₄). La señal se cuantifica midiendo la absorbancia a 450 nm. Los valores de IC50 se determinan para este compuesto utilizando el método del efecto mediano.

• Líneas celulares

  Various NSCLC cell lines

• Concentraciones

  0-20 nM

• Tiempo de incubación

  72 hours

• Método

  Growth and inhibition of growth is assessed by 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay. This assay, a colorimetric method fordetermining the number of viable cells, is based on the bioreduction of MTS by cells to a formazan product that is soluble in cell culture medium, can be detected spectrophotometrically. The cells are exposed totreatment for 72 hours, and the number of cells used per experiment is determined empirically. All experimental points are set up in 6 to 12 wells, and all experiments are repeated at least thrice. The data are graphically displayed using GraphPad Prism version 3.00 for Windows (GraphPad Software). The curves are fitted using a nonlinear regression model with a sigmoidal dose response.

• Modelos animales

  HCC827-GFP or HCC827-Del/T790M lung cancer cells (in 0.2 mL of PBS) are inoculated s.c. into the lower-right quadrant of the flank of nude mice

• Dosificaciones

  10 mg/kg

• Administración

  Administered via oral gavage