Ozanimod

En células S1P1R-HEK293T, Ozanimod induce una internalización y degradación sostenidas de S1P1R. [1]

In vivo, Ozanimod muestra una alta biodisponibilidad oral y volumen de distribución. En un modelo de ratón de EAE inducida por MOG, este compuesto (3 mg/kg, p.o.) suprime los síntomas clínicos. En un modelo de TNBS en rata de enfermedad inflamatoria intestinal, (1,2 mg/kg, p.o.) inhibe las puntuaciones clínicas e histológicas de la enfermedad. En un modelo de transferencia adoptiva de células T CD4+CD45Rbhi ingenuas, esta sustancia química (1,2 mg/kg, p.o.) también redujo significativamente la gravedad de la enfermedad, evaluada mediante la medición del grado de inflamación, pérdida glandular, hiperplasia, infiltrado de neutrófilos y grosor de la mucosa. [1]

• Ensayos farmacológicos in vitro

  Los ensayos de señalización celular utilizaron el ensayo LiveBLAzer-FRET B/G para detectar cAMP (S1P1R) o señalización de β-arrestina (S1P4R). Los ensayos se realizan en placas de 384 pocillos por triplicado según las instrucciones del fabricante. Las soluciones de los compuestos se almacenan a 10 mM en 100% DMSO a -80°C, y se diluyen inicialmente 1:10 con 20% (2-hidroxipropil)-β-ciclodextrina. Se genera una curva de respuesta a la dosis de 10 puntos a 40 veces la concentración final del ensayo en 10 mM Hepes pH 7,4, conteniendo 0,1% Pluronic F-127. Para el ensayo S1P1R, se incluyen 80 μM de forskolina en el diluyente. Brevemente, 10⁴ células/pocillo se incuban con una dosis-respuesta del ligando a 37°C durante 4 horas. Se añaden el sustrato CC4-AM y el probenecid y se incuban a 37°C durante 2 horas adicionales y se analizan con un SpectramaxM5. Para los ensayos de cAMP de S1P1R, los datos se normalizan a la fluorescencia máxima generada por 2 μM de forskolina. Para los ensayos de unión de GTPγS, 1-5 μg/pocillo de proteína de membrana se incuban con 10 μM de GDP, 100-500 μg/pocillo de perlas SPA PVT de aglutinina de germen de trigo en 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 20 μg/ml de saponina y 0,1% de BSA libre de ácidos grasos durante 15 minutos en placas de 96 pocillos. Después de la adición del compuesto y 200 pM de GTP [35S] (1250 Ci/mmol), las placas se incuban durante 120 minutos y se centrifugan a 300 g durante 5 minutos. La radioactividad se detecta con un instrumento TopCount. Todos los datos se ajustan con una regresión no lineal de cuatro parámetros de pendiente variable (GraphPad Prism) para generar la concentración efectiva media máxima (EC50) y la eficacia máxima relativa a S1P.

• Líneas celulares

  HEK293T cells

• Concentraciones

  1 μM

• Tiempo de incubación

  1 h

• Método

  Cells expressing S1P1 receptors were incubated with vehicle control or 1 μM this compound for 1 h.

• Modelos animales

  MOG-induced EAE model in C57Bl6 mice, TNBS model of inflammatory bowel disease in male Sprague Dawley rats, and Na飗e CD4+CD45Rbhi T cell adoptive transfer model in SCID mice

• Dosificaciones

  0.1-3 mg/kg

• Administración

  p.o.