NVP-BSK805 2HCl

El dominio cinasa humano JAK2 (aminoácidos 840-1132) está contenido en el constructo plasmídico pAcG2TtevJAK2. Se diseñan los constructos plasmídicos para JAK3 (813-1124), TYK2 (888-1187) y JAK1 (866-1154). La generación de los baculovirus recombinantes con ADN linealizado BD BaculoGold^TM Bright, el ensayo de placa y la amplificación del virus a partir de placas individuales se realizan según el manual (BD Biosciences Pharmingen). Los dominios de la cinasa Janus se expresan en células Sf9 en matraces de agitación de 400 mL con 100 mL de medio de cultivo ExCell420 (JRH Biosciences Ltd) con solución de penicilina/estreptomicina durante 48 h a 27 °C. Las células de cultivo en suspensión se infectan a una densidad de 1 × 10⁶ y la multiplicidad de infección (MOI) para cada virus se optimiza para el rendimiento de proteína soluble. El dominio cinasa de JAK2 humano y de JAK1, JAK3 y TYK2 se expresa a un MOI de 1 y 0,5, respectivamente. El tiempo de expresión a 27 °C es de 48 horas para JAK2 y de 48 horas o 72 horas para JAK1, JAK3 y TYK2. Cuarenta y ocho o setenta y dos horas después de la infección, las células de un cultivo de expresión de 100 mL se cosechan por centrifugación a 3000 x g durante 5 minutos y se lisan con 12 mL de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM ortovanadato de sodio, 1 % Triton X-100, 10 % glicerol, 1 x cóctel completo de inhibidores de proteasa sin EDTA (Roche Diagnostics) y 12,5 U/mL Benzonase durante 30 minutos a 4 °C, seguido de centrifugación a 14 000 × g durante 45 minutos para pelletar el material insoluble. Para la purificación por afinidad con etiqueta GST de las proteínas del dominio cinasa, todos los pasos se realizan a 4 °C. Los lisados clarificados se incuban con 0,2 mL de una suspensión al 50 % de glutatión sefarosa 4B lavada durante 2 horas a 4 °C, seguido de 5 lavados con 1 mL de 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT y 10 % glicerol. La proteína unida se eluye en 5 alícuotas, cada una comenzando con una incubación de 10 minutos con 0,25 mL de tampón de elución (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT, 10 % glicerol, 10 mM L-glutatión reducido). Los eluidos se concentran aproximadamente 5 veces con columnas de centrifugación Amicon Ultra-4. Después de la adición de Brij35 a una concentración final del 0,1 %, la proteína se congela rápidamente en pequeñas alícuotas y se almacena a -80 °C. En estas condiciones, las actividades cinasas son estables durante al menos 6 meses. Las enzimas del dominio cinasa JAK se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente en un medio que contiene 0,1 μM [γ³³P]-ATP, 1 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂, 30 μM de sustrato peptídico sintético EQEDEPEGDYFEWLE, 1 mM DTT, 1 % DMSO, 50 μg/mL BSA, 0,01 % Brij35 y 50 mM Tris-HCl pH 7,5. La concentración de ATP está por debajo del Km para todas las proteínas. Las curvas se ajustan mediante regresión no lineal utilizando la ecuación logística y la función de ajuste global de XLfit® (modelo 205). La expresión y caracterización de JAK2 de tipo salvaje de longitud completa y mutante V617F, así como las condiciones del ensayo cinasa, se han descrito en otros lugares. La selectividad cinasa de NVP-BSK805 se evalúa en un panel cinasa interno: En los ensayos Caliper, las reacciones cinasas se llevan a cabo con sustratos peptídicos que migran con diferentes velocidades en un campo eléctrico cuando están fosforilados. Los péptidos llevan una etiqueta fluorescente para permitir la detección y cuantificación de los péptidos en un sistema capilar. Las intensidades de fluorescencia de los péptidos se cuantifican utilizando el instrumento LC3000 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, EE. UU.). La actividad cinasa se mide cuantificando la cantidad de ATP que queda en solución después de una reacción cinasa. En los ensayos cinasa LanthaScreen™ TR-FRET, se utiliza terbio como quelato de lantánido combinado con un anticuerpo dirigido contra el sustrato fosforilado.

Ba/F3 cells

100 nM

72 hours

The anti-proliferative activity of JAK2 inhibitors is determined by incubating cells for 72 hours with an 8-point concentration range of compound and cell proliferation relative to DMSO-treated cells is measured using the colorimetric WST-1 (Roche Diagnostics GmbH) cell viability readout. Of each triplicate treatment, the mean is calculated and these data are plotted in XLfit 4 (ID Business Solutions, Ltd.) to determine the half-maximal growth inhibition (GI50) values.

RhEpo-induced polycythemia model in Female BALB/c mice

50, 75, and 100 mg/kg

Once daily oral administration