NMS-873

La actividad ATPasa y los parámetros cinéticos de la VCP recombinante de tipo salvaje y sus mutantes se evalúan monitorizando la formación de ADP en la reacción, utilizando un ensayo acoplado a NADH modificado. Dado que el ADP y el NADH son inhibidores competitivos de ATP de la actividad ATPasa de VCP, el protocolo estándar para el ensayo acoplado a NADH se modifica a un procedimiento de dos pasos. En la primera parte, un sistema regenerador de ATP (40 U/ml de piruvato quinasa y 3 mM de fosfoenolpiruvato) recicla el ADP producido por la actividad de VCP, mantiene la concentración del sustrato constante (evitando así la inhibición del producto) y acumula una cantidad estequiométrica de piruvato. En la segunda parte, la reacción enzimática de VCP se detiene con 30 mM de EDTA y 250 μM de NADH y se oxida estequiométricamente con 40 U/ml de lactato deshidrogenasa para reducir el piruvato acumulado. La disminución de la concentración de NADH se mide a 340 nm utilizando una placa lectora Tecan Safire 2. El ensayo se realiza en placas UV de 96 o 384 pocillos en un tampón de reacción con 50 mM de Hepes, pH 7,5, 0,2 mg/mL de BSA, 10 mM de MgCl₂ y 2 mM de DTT. Los datos experimentales se ajustan con una ecuación cooperativa obteniendo un Ks* de aproximadamente 60 μM y un coeficiente de Hill (n) de 2,0 ± 0,1. La campaña HTS se realiza contra una biblioteca de 1 millón de compuestos utilizando un ensayo miniaturizado en formato de 1.536 pocillos y un sistema de detección de ADP más sensible, Transcreener ADP FP. Se realiza una preincubación de 20 minutos de 10 nM de VCP y 10 μM de inhibidor, después de lo cual se añaden 10 μM de ATP a la reacción, que se deja proceder durante 90 minutos antes de detenerla. El Z′ promedio del cribado es de 0,58, y la tasa de aciertos utilizando 3× d.e. (38 % de inhibición) como punto de corte es del 1,7 %. Los aciertos primarios con >60 % de inhibición a una concentración de 10 μM se depuran utilizando filtros fisicoquímicos y estructurales para dejar 7.516 compuestos. Al final, se realiza una reconfirmación por duplicado en 3.988 aciertos primarios, y se seleccionan 500 compuestos para una evaluación de dosis-respuesta utilizando el ensayo acoplado modificado con NADH descrito anteriormente. La potencia de los aciertos HTS más interesantes se mide tanto contra la VCP de tipo salvaje como contra el mutante C522T. Las concentraciones de ATP que produjeron la velocidad semimáxima (Ks*) para cada enzima, correspondientes a 60 μM y 130 μM para el tipo salvaje y el mutante C522T, respectivamente, se utilizan en el ensayo. Para explorar la dependencia de los inhibidores reversibles de la concentración del sustrato, su potencia se evalúa también a una concentración saturante de ATP (1 mM) y se compara con la potencia de un inhibidor competitivo estándar de ATP (AMP-PNP).

A variety of hematological and solid tumor lines

~10 μM

72 hours

Cells are seeded at 1,600 cells per well in 384-well white clear-bottom plates. Twenty-four hours after seeding, cells are treated with the compounds (eight dilution points, in duplicate, for each compound) and incubated for an additional 72 h at 37 °C under a 5% CO₂ atmosphere. Cells are then lysed, and the ATP content in each well is determined using a thermostable firefly luciferase–based assay as a measure of cell viability. IC50 values are calculated using the percentage of growth of treated cells versus the untreated control.