BIBF 1120 (Nintedanib)

BIBF1120 inhibe la actividad quinasa de PDGFR de los tipos PDGFR alfa y PDGFR beta con valores de IC50 de 59 nM y 65 nM, respectivamente. Además, BIBF1120 suprime los subtipos de FGFR con IC50 de 60 nM, 37 nM y 108 nM para FGFR1, FGFR2 y FGFR3, respectivamente. BIBF1120 se une al sitio de unión de ATP en la hendidura entre los lóbulos N-terminal y C-terminal del dominio quinasa. El andamiaje de indolinona forma dos enlaces de hidrógeno con el nitrógeno del esqueleto de Cys⁹¹⁹ y el oxígeno carbonilo del esqueleto de Glu⁹¹⁷ en la región de la bisagra. BIBF 1120 inhibe la proliferación de BRP estimuladas por PDGF-BB con una EC50 de 79 nM en ensayos celulares. BIBF1120 a concentraciones tan bajas como 100 nM bloquea la activación de MAPK después de la estimulación con 5% de suero más PDGF-BB. En cultivos de células musculares lisas vasculares humanas (HUASMC), BIBF1120 previene la proliferación estimulada por PDGF-BB con una EC50 de 69 nM. [1]

En todos los modelos tumorales probados hasta ahora, incluyendo xenoinjertos tumorales humanos que crecen en ratones desnudos y un modelo de tumor de rata singénico, BIBF1120 es altamente activo a dosis bien toleradas (25-100 mg/kg diarios p.o.). Esto es evidente en la resonancia magnética de la perfusión tumoral después de 3 días, reduciendo la densidad vascular y la integridad vascular después de 5 días, y una profunda inhibición del crecimiento. [1]

• Ensayo de Kinasa VEGFR2

  El dominio citoplasmático de tirosina quinasa de VEGFR2 (residuos 797-1355 según la secuencia depositada en el banco de datos SWISS-PROT P35968) se clona en pFastBac fusionado a GST y se extrae. La actividad enzimática se ensaya en presencia o ausencia de diluciones seriadas de BIBF1120 realizadas en DMSO al 25%. Cada placa de microtitulación contiene controles internos como blanco, reacción máxima y compuesto de referencia histórico. Todas las incubaciones se realizan a temperatura ambiente en un agitador rotatorio. Se añaden 10 μL de cada dilución de BIBF1120 a 10 μL de quinasa diluida (0,8 μg/mL VEGFR2, 10 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA y 2 mg/mL BSA) y se preincuban durante 1 hora. La reacción se inicia mediante la adición de 30 μL de mezcla de sustrato que contiene 62,4 mM Tris pH 7,5, 2,7 mM DTT, 5,3 mM MnCl₂, 13,3 mM Mg-acetato, 0,42 mM ATP, 0,83 mg/mL Poly-Glu-Tyr(4:1) y 1,7 μg/mL Poly-Glu-Tyr(4:1)-biotina y se incuba durante 1 hora. La reacción se detiene mediante la adición de 50 μL de 250 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,4. Se transfieren 90 μL de la mezcla de reacción a una placa de estreptavidina y se incuban durante 1-2 horas. Después de tres lavados con PBS, se añade el anticuerpo marcado con EU, PY20 (dilución recomendada 1:2000 de anticuerpo marcado a 0,5 mg/mL en tampón de ensayo DELFIA). El anticuerpo de detección excesivo se elimina mediante tres lavados con tampón de lavado DELFIA. Luego, 10 minutos antes de la medición en el lector multietiqueta, cada pocillo se incuba con 100 μL de solución de mejora DELFIA.

• Líneas celulares

  HUVEC, HUASMC, and BRP cell lines

• Concentraciones

  50 nM

• Tiempo de incubación

  2 hours

• Método

  The cell lines HUVEC, HUASMC, and BRP are used for the assay. BIBF1120 is added to the cultures two hours before the addition of ligands. Cell lysates are generated. Western blotting is done using standard SDS-PAGE methods, loading 50 to 75 μg of protein per lane. Detection is facilitated by enhanced chemiluminescence. Total and phosphorylated mitogen-activated protein kinase (MAPK) is analyzed using monoclonal antibodies M3807 and M8159. Total Akt is detected using the corresponding polyclonal antibody and phosphorylated Akt (Ser473) is analyzed by using its monoclonal antibody. Monoclonal antibody is also used to detect cleaved caspase-3 while KDR (VEGFR2) protein is detected using a corresponding antibody.

• Modelos animales

  FaDu, Caki-1, SKOV-3, H460, HT-29, or PAC-120 xenografts in Athymic NMRI-nu/nu female mice

• Dosificaciones

  100 mg/kg

• Administración

  p.o.