MK-5108

MK-5108 inhibe la actividad de Aurora-A de manera competitiva con el ATP. Este compuesto muestra una robusta selectividad contra las otras quinasas de la familia Aurora-B (220 veces) y Aurora-C (190 veces) en el ensayo bioquímico. También revela una alta selectividad para Aurora-A sobre otras proteínas quinasas. El compuesto inhibe solo una quinasa (TrkA) con una selectividad <100 veces. Puede ser más selectivo para Aurora-A que MLN8054. Consistente con la inducción de células pHH3-positivas, este químico induce la acumulación de células en la fase G2-M. Inhibe la proliferación de células tumorales, incluyendo HCC1143, AU565, MCF-7, HCC1806 y CAL85-1 con una IC50 de 0,42 μM, 0,45 μM, 0,52 μM, 0,56μM y 0,74 μM, respectivamente. [1] Este compuesto disminuye la viabilidad celular de forma dosis-dependiente en las tres líneas celulares, incluidas las células LEIO285, LEIO505 y SK-LSM1, con una IC50 de aproximadamente 100 nM. La incubación con él en LEIO285 aumenta la proporción de células en G2/M a las 48 y 72 horas post-tratamiento. El compuesto aumenta significativamente la actividad de la Caspasa 3/7 en comparación con los cultivos control tratados con DMSO en ambos puntos de tiempo. En las células LEIO505, provoca una mayor acumulación de células en las fases G2/M a las 24 horas, pero no a las 48 o 72 horas.  [2]

MK-5108 induce células pHH3-positivas a dosis de 16 mg/kg y 32 mg/kg. La concentración plasmática de este compuesto a 8 mg/kg y 16 mg/kg es de 1,7 μM y 4,4 μM, respectivamente. El tratamiento con este compuesto da como resultado la inducción de pHH3 en tejidos tumorales y cutáneos, que comienza a las 2 horas y alcanza un máximo a las 4 horas. Los tratamientos químicos a 15 mg/kg y 30 mg/kg dan como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral con un cambio en el volumen tumoral medio para el grupo de tratamiento como porcentaje del cambio medio en el grupo control (%T/C) del 10 % y −6 % en el día 11, y 17 % y 5 % en el día 18, respectivamente. Se tolera bien en ambas dosis, con una reducción mínima del peso corporal. Este compuesto también exhibe una actividad antitumoral significativa a través de la dosificación intermitente en ratas desnudas portadoras de tumores SW48; a 15 mg/kg y 45 mg/kg causa una inhibición del crecimiento tumoral dosis-dependiente con un %T/C del 35 % y 7 % en el día 10, y 58 % y 32 % en el día 27, respectivamente. [1]

• Ensayos bioquímicos de quinasas

  La proteína Aurora-A humana recombinante con etiqueta His se expresa en Escherichia coli y se purifica con una columna HisTrap HP. Se adquieren las proteínas Aurora-B y Aurora-C humanas recombinantes purificadas. Los experimentos se realizan por quintuplicado en placas de 96 pocillos. La reacción del ensayo de Aurora-A se lleva a cabo en presencia de 20 μM de ATP, 25 μM de Tetra-Kemptide [RRR(GLRRASLG)₄R-NH₂], 1,0 μCi por pocillo de [γ-³³P]-ATP, 0,1 ng por pocillo de Aurora-A en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 15 mM de Mg(OAc)₂ y 0,2 mM de EDTA a 30°C durante 40 minutos. Para investigar el modo de inhibición de MK-5108 para Aurora-A, se determinan los valores de IC50 de este compuesto en presencia de diferentes concentraciones de ATP. Luego, el valor de IC50 se grafica en función de la concentración de ATP para analizar el efecto de la concentración de ATP en el valor de IC50 de este químico. La reacción del ensayo de Aurora-B se lleva a cabo en presencia de 15 μM de ATP, 100 μM de Kemptide (GLRRASLG-NH₂), 1,0 μCi por pocillo de [γ-³³P]-ATP, 5,0 ng por pocillo de Aurora-B en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 15 mM de Mg(OAc)₂ y 0,2 mM de EDTA a 30 °C durante 20 minutos. La reacción del ensayo de Aurora-C se lleva a cabo en presencia de 40 μM de ATP, 100 μM de Kemptide, 1,0 μCi por pocillo de [γ-³³P]-ATP, 15 ng por pocillo de Aurora-C en 10 mM de MOPS-NaOH (pH 7,4), 5 mM de Mg(OAc)₂, 1 mM de (±) DTT y 1 mM de EGTA a 30°C durante 20 minutos. Después de que las reacciones de quinasa se terminan agregando 2,0 % de ácido fosfórico, el Tetra-Kemptide o Kemptide se atrapa en la placa MultiScreen-PH. Los pocillos se lavan cinco veces con 0,64 % de ácido fosfórico y luego se monitorea la radioactividad en un contador de centelleo líquido.

• Líneas celulares

  HeLa-S3 cells

• Concentraciones

  0 μM -1 μM

• Tiempo de incubación

  12 hours

• Método

  HeLa-S3 cells are synchronized at the G1-S phase boundary by double thymidine block with 2 mM thymidine. Cells are washed and seeded to 96-well cell culture plates. After 4 hours, an equal volume of medium containing MK-5108 is added to each well. Nocodazole (300 nM) is used as a 100% control. The cells are fixed overnight with cold methanol 12 hours after seeding. Then, the cells are stained with rabbit anti-phospho-histone H3 Ser28 antibody and then with anti-rabbit IgG-Cy5. Total nuclei are stained with 10 mg/mL 4^′,6-diamidino-2-phenylindole. Immunostained images are acquired using the IN Cell Analyzer1000 with ×10 objective lens. After acquisition of images, data are analyzed. The %pHH3-positive index is determined by measuring the %pHH3-positive cell counts per total nuclei counts for each sample, then by normalizing with respect to nocodazole-treated cells.

• Modelos animales

  SCID mice bearing HCT116 tumors

• Dosificaciones

  30 mg/kg

• Administración

  Oral administration